金丝桃苷对体外肿瘤细胞增殖的抑制作用研究

王丽敏,江清林,毕士有,史伟国,赵锦程,张明远

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007)

贯叶金丝桃为藤黄科金丝桃属多年生草本植物,具有清热解毒、抗抑郁、抗病毒等功效[1]。金丝桃苷(Hyperin,Hyp)属黄酮醇苷化合物,是金丝桃属植物的特征性成分之一。金丝桃苷毒性小,具有镇痛、抗炎、止咳、抗氧化、保护心血管系统等多种药理学活性[2,3]。现在人们对金丝桃苷的毒理、药理等基础研究都做了大量的工作,并取得了丰硕的成果,但是金丝桃苷对体外肿瘤细胞增殖的抑制作用研究却少有报道。本实验选用人肺腺癌细胞 A549、结肠癌细胞 HCT8及前列腺癌细胞 PC3作为研究对象,对金丝桃苷体外抗肿瘤作用进行初步探讨,从而为开发出金丝桃苷的临床新用途提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

A549细胞、HCT8细胞及 PC3细胞均购于中国医学科学院基础医学研究所。金丝桃苷购自北京生物制品研究所,用二甲基亚砜溶解(终浓度≤0.01%),用含 2%小牛血清RPM I1640培养液稀释至终浓度;四甲基偶氮唑蓝(M TT)、胰蛋白酶购自美国 Sigma公司;小牛血清、青-链霉素双抗、RPM I1640培养液购自天津灏洋生物公司;Fax-3200酶标仪购自美国 Awareness公司。

1.2 方法

1.2.1 A549细胞、HCT8细胞及 PC3细胞的培养

人肿瘤细胞 A549、HCT8、PC3均为贴壁生长细胞,加入含 10%小牛血清,100U/mL青-链霉素的 RPMI1640培养液,置于 37℃恒温、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养。胰蛋白酶消化、传代、繁殖细胞。

1.2.2 A549细胞、HCT8细胞及 PC3细胞形态的变化

取对数生长期肿瘤细胞用 0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,用含 10%小牛血清的 RPMI1640培养液配成单个细胞悬液 ,以每孔 1× 105个细胞接种于 96孔培养板中,培养24h后,换液,加入不同浓度的金丝桃苷 (0.625 μg/mL,1.25 μg/mL,2.5μ g/mL,5μ g/mL,10 μg/mL,20μ g/mL)。 同时设阴性对照组为不加药物只加等量二甲基亚砜;另设终浓度为 10 μg/mL的 5-FU阳性对照组及不加细胞只加等量药物的空白对照组。置 5%CO2培养箱内分别培养 24h、48h、72h。在倒置显微镜下观察细胞生长情况及存活状态。

1.2.3 M TT法检测金丝桃苷对肿瘤细胞的生长抑制作用

取对数生长期 A549细胞、HCT8细胞及 PC3细胞消化后,配成单细胞悬液,以每孔 1×105个细胞接种于 96孔培养板中,每孔体积 100μL,培养 24 h后,换液,加入不同浓度的金丝桃苷 (0.625μ g/mL,1.25 μg/mL,2.5 μg/mL,5 μg/mL,10 μg/mL,20μ g/mL),药物的每一浓度设 4个复孔,同时设终浓度为 10 μg/mL的 5-FU阳性对照组及阴性对照组和空白对照组。加药后再分别培养 24h、48h、72h,每孔加入 MTT溶液(5mg/mL)10 μL,37℃,继续孵育 4h。终止培养,小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入 100μLDM SO,振荡 10min,使结晶物充分溶解。选择 490nm波长,在酶标仪上测定各孔光吸收值(OD值),计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=(对照孔 OD值-实验孔 OD值 )/对照孔 OD值×100%。

1.2.4 数据处理

数据以平均值±标准差表示,组间显著性差异经 t检验验证,以 P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 细胞生长形态变化

在倒置显微镜下可见 A549细胞呈现长梭形,HCT8细胞呈多角形或梭形,PC3细胞呈不规则梭形。培养 24h、48h、72h后,对照组三种细胞均单层贴壁,细胞数量较多,形态正常,生长状态良好。金丝桃苷组、阳性对照组细胞培养 24h后,细胞数量减少 ,细胞形态仍基本正常。金丝桃苷组、阳性对照组细胞培养 48h后,细胞数量明显减少,金丝桃苷浓度高于 5 μg/mL以上时,大量细胞变圆浮起,细胞形态较难辨认。金丝桃苷组、阳性对照组细胞培养 72h后,细胞稀少,金丝桃苷浓度高于 2.5 μg/mL时,多数细胞变圆浮起,当浓度达到 10 μg/mL时已难辨认正常细胞的存在 ,绝大部分呈坏死碎片。

2.2 M TT比色实验

从表1、表2及表3结果可知,金丝桃苷体外可抑制人肺腺癌细胞 (A549)、人结肠癌细胞(HCT8)、人前列腺癌细胞(PC3)的增殖,在 0.625至 20 μg/mL的范围内具有明显的剂量和时间依赖性。作用 24h、48h、72h时随着剂量的增加,抑制作用更加明显,而且随着时间的增加,抑制作用变化明显。表明金丝桃苷对三种肿瘤细胞均有较强的细胞毒活性,其中A549细胞及 HCT8细胞对金丝桃苷的敏感性最高。支严重病变,综合分析考虑该患者冠脉发生如此严重病变可

表1 金丝桃苷对 A549细胞生长抑制率(%)的影响 ±s,n=6)

表1 金丝桃苷对 A549细胞生长抑制率(%)的影响 ±s,n=6)

注:与5-FU对照组比较,*P＞ 0.05。

表2 金丝桃苷对 HCT8细胞生长抑制率(%)的影响 ±s,n=6)

表2 金丝桃苷对 HCT8细胞生长抑制率(%)的影响 ±s,n=6)

注:与 5-FU对照组比较,*P＞ 0.05。

表3 金丝桃苷对 PC3细胞生长抑制率(%)的影响 ±s,n=6)

表3 金丝桃苷对 PC3细胞生长抑制率(%)的影响 ±s,n=6)

注:与5-FU对照组比较,*P ＜0.05。

3 讨论

近年来,植物药在恶性肿瘤治疗中发挥着重要的作用,天然植物药毒性低、疗效好,日益受到重视,成为治疗肿瘤的希望和新途径,是当前抗肿瘤新药研究的主要发展方向。细胞通过分裂生成和本身相同的细胞群体也就是增殖来完成生长过程。肿瘤借助肿瘤细胞的分裂增殖而不断地生长发展。癌细胞不断增生是其侵袭发生的前提之一,抗肿瘤药可通过抑制和杀灭细胞增殖的物质基础来阻断转移的发生[4]。因此我们选择了三种人源癌细胞来研究金丝桃苷体外抗肿瘤活性。实验方法采用 M TT法。实验结果表明,金丝桃苷在一定浓度范围内具有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用,可作为一种天然、低毒、有效的防癌抗癌物质在肿瘤的治疗和预防过程中发挥重要的作用。关于金丝桃苷抗肿瘤作用机制有待于进一步研究。

[1] Josey E S,Tackett R L.St John’s wort:a new alternative for depression[J].International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics,1999,37(3):111-113

[2] Song BW,M a CG,Xu SY.A new peripheral anlgesic agent:hyperin Asia pacific[J].J Pharmacoc,1988,3(2):1-2

[3] 李庆林,陈志武,马传庚.金丝桃苷对原代培养的大鼠心肌细胞缺氧-再给氧损伤的影响[J].中草药,2006,37(4):575-5771995,267(10):1445-1449