外周血辅助性T细胞亚群与肺结核严重性及疗效的关系①

李德宪 张天托 谭守勇 张贤兰 (中山大学附属第三医院呼吸科,广州 510630)

宿主受结核分枝杆菌感染后近期内发病乃至以后发病者仅约10%,且发病者临床表现差异极大,宿主感染后发病与否,及发病的严重程度等,不仅与感染的细菌量及其毒力等因素有关,而且还取决于机体的免疫功能。目前认为机体的抗结核免疫反应主要是通过T淋巴细胞介导巨噬细胞效应的细胞免疫反应,CD4+T细胞按细胞因子产生的模式和生物功能可分为Th1细胞和Th2细胞。为探讨:外周血的Th1和Th2细胞与肺结核病变严重程度的关系;抗结核治疗前后外周血的Th1和Th2细胞的变化;外周血的Th1和Th2细胞及其变化与疗效的关系;我们进行此研究。

1 材料与方法

1.1 研究对象 肺结核患者组:共62例,其中男48例,女14例,年龄 16～88 岁,平均 50.24±20.45岁 。所有患者均符合《肺结核诊断和治疗指南》的诊断标准[1],均具有细菌学或病理学阳性依据。本组肺结核患者无合并糖尿病、艾滋病、甲状腺功能亢进及其他自身免疫性疾病,治疗前未使用免疫调节剂。肺部病灶受累程度分级标准:局限病变是指肺部病灶累及范围少于或等于2个肺野;多叶受累是指肺部病灶累及范围多于2个肺野。疗效判断标准:明显吸收是指治疗后病灶吸收或缩小大于或等于50%以上;吸收不明显是指治疗后病灶吸收或缩小不足50%;恶化是指治疗后病灶范围较前扩大。62例肺结核患者中,局限组20例(单侧局限13例,双侧局限7例),其中空洞形成5例(25.0%);多叶受累组42例(单侧多叶4例,双侧多叶38例),其中空洞形成30例(71.4%)。治疗后24例病灶明显吸收好转,38例病灶吸收不明显。

健康对照组:共30例,其中男19例、女11例,年龄16～50岁,平均34.10±8.11岁。为影像学正常及近期无接触结核病史的正常体检者,PPD皮试为阴性或一般阳性,血清抗结核抗体阴性。

1.2 研究方法 患者入院一周内进行一下检查:痰涂片找抗酸杆菌及痰结核菌培养;采集外周血查血常规、血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)及Th细胞亚群检测;胸部X-线照片(或)胸部CT检查。明确诊断后,接受规则抗结核治疗(应用异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇或链霉素四药联合治疗),治疗过程不使用免疫调节剂,抗结核治疗2月后复查(项目与入院时检查相同)。

Th细胞亚群检测:采用细胞内细胞因子测定法,以胞内INF-γ的表达代表Th1细胞,IL-4的表达代表Th2细胞进行分型,通过流式细胞技术测定。XL-4型流式细胞仪为Beckman Coulter公司产品;TC2323 CO2培养箱为SL公司产品。主要荧光标记单克隆抗体:及相应的同型对照,以及检测抗体所用的绝对计数微球、破膜及固定剂均为Immunotech公司产品;佛波酯、离子霉素、莫能霉素、二甲亚砜、含链霉素青霉素磷酸盐缓冲液等为Sigma公司产品;1640培养液、灭活胎牛血清为Gibco Bre公司产品。严格按说明书要求操作。

1.3 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析;计量资料采用±s表示平均水平,两样本均数的比较用t检验,治疗前后计量资料变化的比较用配对 t检验;计数资料的比较用 χ2检验;P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 治疗前肺结核组与健康对照组的Th1和Th2细胞计数比较 见表1,肺结核组的Th1和Th2细胞的计数均明显低于对照组。

表1 治疗前肺结核组与健康对照组的Th1和Th2细胞计数比较Tab.1 Comparison of Th1 cell count and Th2 cell count between tuberculosis group and controls before antituberculosis therapy

表2 治疗前不同程度肺部病灶受累组肺结核患者的临床特征比较Tab.2 Comparison of characteristics between diffuse group and limited group before antituberculosis therapy

2.2 治疗前不同程度肺部病灶受累组肺结核患者的临床特征比较 见表2,多叶受累组的血沉高于局限组,血红蛋白及Th1细胞计数均低于局限组。另外,无论是多叶受累组还是局限组的Th1细胞计数和Th2细胞计数均低于健康对照组,其中Th1细胞计数在多叶受累组、局限组与健康对照组中呈逐渐增多趋势。

2.3 治疗前病灶吸收明显组与病灶吸收不明显组的临床特征比较 见表3,治疗前两组的Th1、Th2细胞计数、血红蛋白、血沉和C-反应蛋白均无统计学差异,但Th1和Th2细胞计数均较健康组低。

2.4 治疗后病灶吸收明显组与病灶吸收不明显组的临床特征比较 见表4,治疗后病灶吸收明显组的血沉和C-反应蛋白均低于病灶吸收不明显组,病灶吸收明显组的Th1细胞计数恢复至健康水平,病灶吸收不明显组的Th1细胞计数仍低于健康水平,两组Th2细胞计数仍均低于健康组。

2.5 病灶吸收明显组治疗前后的临床特征比较

见表5,治疗后除血红蛋白、血沉和C-反应蛋白明显改善外,Th1细胞计数亦较治疗前有明显增加,且与健康对照组比较无差异;Th2细胞计数则治疗前后相似,仍低于健康对照组。

2.6 病灶吸收不明显组治疗前后的的临床特征比较 见表6,治疗后虽然白细胞计数、血沉和C-反应蛋白较前有改善,但血红蛋白改变不大,且仍显著低于健康组;Th1细胞计数虽较前有明显增加,但仍显著低于健康对照组;Th2细胞计数则较治疗前有降低,明显低于健康组。

表3 治疗前病灶吸收明显组与病灶吸收不明显组的的临床特征比较Tab.3 Comparison of characteristics between improved group and stable group before antituberculosis therapy

表4 治疗后病灶吸收明显组与病灶吸收不明显组的临床特征比较Tab.4 Comparison of characteristics between improved group and stable group after two months of antituberculosis therapy

表5 病灶吸收明显组治疗前后的临床特征比较(n=24)Tab.5 Comparison of characteristics before and after two months of antituberculosis therapy in improved group(n=24)

表6 病灶吸收不明显组治疗前后的临床特征比较(n=38)Tab.6 Comparison of characteristics before and after two months of antituberculosis therapy in stable group(n=38)

表7 病灶吸收明显组与病灶吸收不明显组前后的临床特征变化的比较Tab.7 Comparison of characteristics before and after therapybetween improved group and stable group

2.7 病灶吸收明显组与病灶吸收不明显组治疗前后的临床特征变化比较 见表7,病灶吸收明显组的Th1细胞计数的增加值显著较病灶吸收不明显组多,Th2细胞计数、血红蛋白、血沉、C-反应蛋白的变化值则相似。

3 讨论

传统上,肺结核肺部病灶受累程度分级标准通常依据影像学上是否形成空洞病灶而划分,如同是菌阴肺结核,有空洞者治疗疗程则须相应延长。有关肺结核病变的病理形成过程现已较明确,空洞是否出现是感染细菌的数量、毒力及机体免疫功能共同作用的结果,机体免疫力严重缺乏时,并不形成空洞,如艾滋病患者合并肺结核,多出现中下肺广泛播散灶,但少见空洞形成,又如临床上认为较危重的血行播散型肺结核也少见空洞形成,可见以空洞形成与否作为肺结核严重性的判断标准存在不足。我们认为,由于结核病免疫反应具有不平衡性,在不同的肺叶,甚至同一肺叶乃至同一病变的不同部位可以同时存在处于不同病程的病变的特点,以肺部病灶累及范围多少作为肺结核严重性的判断标准更趋合理,此外以病灶播散程度来探讨外周血中细胞的免疫功能也更科学。在我们研究的所有62例肺结核患者中,影像学显示有空洞形成者35例,未见空洞者27例,按我们标准划分,局限组20例,其中空洞形成5例(25.0%),多叶受累组42例,其中空洞形成30例(71.4%),多叶受累组空洞形成明显高于局限组,两组差异有显著性统计学意义(P=0.001,χ2检验)。由于影像学观察容易出现因阅片者不同而出现差异,为验证我们的影像学分度的准确性,我们同时比较不同肺部病灶受累程度患者的血红蛋白、C-反应蛋白和血沉,结果如表2所示,多叶受累组的血红蛋白109.83±25.06(g/L)明显低于局限组的128.95±17.29(g/L),血沉82.60±42.74(mm/h)明显高于局限组的42.50±32.99(mm/h),C-反应蛋白67.14±65.33(mg/L)也高于局限组的42.01±68.74(mg/L),证实影像学结果与临床表现的一致性。

自1986年Mosmann等[2]发现,小鼠CD4+T细胞按细胞因子产生的模式和生物功能,有两种极不相同的亚群,分别称为Th1细胞和Th2细胞以来,有关Th1/Th2的平衡与结核病的关系成为研究的热点。由于研究样本的种属差异、个体差异、不同发病时期、不同严重程度、不同研究方法等,研究结果存在争议,具体表现为同是外周血或同是病变部位的研究结果的不一致性,以及病变部位与外周血表现的差异。如在外周血研究方面,Zhang等[3]报道结核病人的外周血细胞的Th1反应型并不伴随Th2反应增高;但Surcel等[4]报道活动性肺结核患者以Th2样细胞数量增多为主,Th1细胞未见减少。Lienhardt等[5]报道了大样本临床研究结果,提示:外周血较低下的Th1型反应和/或更强的Th2型反应者,患结核风险更高;上调Th1型反应可能有助于提高抗结核疗效。Handzel等[6]则认为急性结核病外周血Th1和Th2型反应均增强。Sahiratmadja等[7]发现活动性结核组的Th1型反应明显低于对照组,且与疾病严重程度紧密关联,病情越严重则Th1型反应越低,治疗后Th1型反应可恢复至接近正常水平,结核组的Th2型反应则治疗前稍高于对照组,治疗后则降低至对照组水平。

由于结核病免疫反应具有不平衡性,在不同的肺叶,甚至同一肺叶乃至同一病变的不同部位可以同时存在处于不同病程的病变,因此,我们认为外周血液可能更能反映机体总体免疫状况。另外,不同的发病时期,机体免疫反应也不相同,我们采用抗结核治疗前后不同时期的动态比较可更好解决不同疾病时期免疫应答可能不同的问题。细胞内细胞因子测定能更直接、更准确地反映体内Th1及Th2细胞的实际情况。因此,本研究采用细胞内细胞因子测定法,以胞内INF-γ的表达代表Th1细胞,IL-4的表达代表Th2细胞进行分型,通过流式细胞技术,对不同严重程度的结核病患者及治疗前后不同时期的外周血液进行Th细胞计数来研究结核病患者Th1/Th2细胞免疫应答失调与临床病变严重程度、疾病转归、预后的关系。

本研究显示,治疗前肺结核患者Th1细胞计数低于健康者,而且肺部病灶受累程度越严重,Th1细胞计数则越低;治疗后,肺部病灶吸收明显者,Th1细胞计数升高得多,达到甚至超过健康水平,而病灶吸收不明显者的Th1细胞计数虽然较治疗前有明显增加,但仍低于健康水平。与Zhang等[3]及Lienhardt等[5]的大型临床研究报道一致。尤其是Lienhardt等的研究,虽然研究方法及选用的Th1型因子与本研究不同,但其研究也表明Th1型反应低下与结核病的发生有关,而且低下的Th1型反应在有效抗结核治疗后出现明显增加,甚至超过正常对照组,但两者也存在一定区别,Lienhardt等研究显示Th1型反应恢复性增加值达到甚至超过正常对照组的时间需在抗结核后6个月,而本研究仅需2个月,还有Lienhardt等是所有入选肺结核患者(无论治疗反应如何)的平均反应,未对患者作进一步分层分析,而本研究显示,并非所有肺结核病人经过抗结核治疗后均可出现此反应,只有疗效明显者才会出现此变化,疗效不明显者Th1细胞计数虽然较治疗前有明显增加,但仍低于健康水平,推测结核病的发生和进展可能与Th1细胞低下有关,成功的抗结核治疗后,Th1细胞随之恢复,上调Th1型反应可能有助于提高抗结核疗效。

有关Th2细胞方面,本研究显示,治疗前肺结核患者无论肺部病灶受累广泛与否,Th2细胞计数均低于健康对照组,差异有显著性统计学意义,而且病情轻重患者间Th2细胞计数并无差异;治疗后,低水平的Th2细胞计数并不回升,在病灶吸收不明显患者中甚至出现进一步下降趋势。与Zhang等[3]及Lienhardt等[5]研究Th1型反应低下但Th2型反应相似或升高不同,可能与研究方法不同有关,Zhang等[3]及Lienhardt等[5]研究采用细胞外细胞因子测定方法,本研究采用细胞内细胞因子测定法。Lin等[8]用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定外周血及淋巴结内细胞因子表达的研究均提示结核病发病是以Th1型免疫反应低下为主,而非Th2型免疫反应增强,本研究这进一步证实这一发病机理。推测治疗后好转明显患者,由于Th1细胞上升,有足够的Th1型免疫保护,为维持Th1/Th2平衡,Th2细胞亦出现轻微的上调;而病灶吸收不良患者,由于治疗后虽然Th1细胞较前有一定升高,但仍远低于健康者,为维持足够的Th1型免疫保护机体,而下调Th2细胞。

综上所述,我们认为,结核病的发生和进展可能与Th1细胞低下有关,而非Th2型免疫反应增强所致,成功的抗结核治疗后,Th1细胞随之恢复。然而,免疫细胞和细胞因子的作用是复杂的和多方面的,在机体不同的状态时,它们所起的作用也不相同,并且能够被很多物质调节。目前,细胞因子的作用尚未彻底明了,相信随着研究的深入,将有助于在抗结核治疗中引入新的特异性免疫治疗。

1 中华医学会结核病学分会.肺结核诊断和治疗指南[J].中华结核和呼吸杂志,2001;24(1):70-74.

2 Mosmann T R,Chewinski H,Bond M W et al.Two types of murine helper T cell clone.I.Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins[J].J Immunol,1986;136(7):2348-2357.

3 Zhang M,Lin Y,Dinakar V et al.T cell cytokine responses in human infection with mycobacterium tuberculosis[J].Infection and Immunity,1995;63(8):3231-3234.

4 Surcel HM,Troye-Blomberg M,Paulie S et al.Th1/Th2 profilesintuberculosis,based on the proliferation and cytokine response of blood lymphocytes to mycobacterial antigens[J].Immunology,1994;81(2):171-176.

5 Lienhardt C,Azzurri A,Amedei A et al.Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo[J].Eur J Immunol,2002;32(6):1605-1613.

6 Handzel Z T,Barak V,Altman Y et al.Increased Th1 and Th2 type cytokine production in patients with active tuberculosis[J].Isr Med Assoc J,2007;9(6):479-483.

7 Sahiratmadja E,Alisjahbana B,de Boer T et al.Dynamic changes in proand anti-inflammatory cytokine profiles and gamma interferon receptor signaling integrity correlate with tuberculosis disease activity and response to curative treatment[J].Infect Immun,2007;75(2):820-829.

8 Lin Y,Zhang M,Hofman F M et al.Absence of a prominent Th2 cytokine response in human tuberculosis[J].Infect Immun,1996;64(6):1351-1356.