IL-1β、IL-6和IL-23对原发性胆汁性肝硬化患者Th17细胞形成的影响①

邓日辉 陈 颖 黄 羽 孙 静 何 敏 周 丹 曾 星 陈曲波

(广州中医药大学第二临床医学院免疫室,广州 510120)

原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种慢性炎症性、进行性肝内胆汁淤积性自身免疫性肝病[1]。该病女性多发,与患者体内产生抗线粒体抗体(AMA)特别是其M2亚型密切相关,确切病因至今不明[2]。Th17细胞是近年发现的以分泌白介素17(IL-17)为主要特征的新的CD4+T细胞亚型,在自身免疫疾病和感染性疾病中发挥重要调节作用[3]。新近发现PBC患者肝组织中Th17细胞明显高于健康人群[4],Th17细胞过度增殖的确切机制还不清楚。国外报道体外诱导Th17细胞分化与多种细胞因子密切相关,特别是 IL-1β、IL-6和 IL-23等在诱导时起到十分关键的作用[5,6]。这些细胞因子是否影响PBC患者Th17细胞的分化,目前尚未见报道。为此,我们从PBC患者和正常人外周血中分离初始T细胞,通过在体外培养中加入IL-1β、IL-6和IL-23,观察这些细胞因子对PBC患者初始T细胞向Th17细胞分化的影响,并与正常人初始T细胞的分化进行比较,为揭示Th17细胞形成与PBC的相关性提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 PBC患者15例,女性13例,男性2例,平均年龄(51.2±8.6)岁,均为2008年7月-2009年9月来广东省中医院或中山大学医学院附属第三医院就诊的PBC患者,在采血前均未用过糖皮质激素类、熊去氧胆酸及其他免疫抑制/增强剂治疗。PBC的诊断按照2000年美国肝脏病研究协会推荐的PBC诊治标准:(1)肝内淤胆的临床症状和体征,肝功能指标异常,特别是胆汁淤积的证据;(2)腹部B超、CT或逆行胰胆管造影排除其他胆道梗阻因素;(3)血清抗线粒体抗体(AMA)≥1∶1 000且AMAM2阳性。同时以20例健康献血者为对照组,年龄、性别与PBC组匹配,其中女性17例,男性3例,平均年龄(48.5±9.7)岁,均无肝脏相关疾病及自身免疫性疾病病史。

1.2 试剂与仪器 人初始CD4+T细胞磁珠分选试剂盒、磁力架、抗人PE-CD45RA均购自德国Miltenyi公司。IL-6、IL-1β购自 Peprotech公司。IL-23购自R&D 公司 。Anti-CD3、anti-CD28、anti-IFN-γ、anti-IL-4,抗人 FITC-CD4、抗人 PE-IL-17、PMA、Inomycin、cell staining buffer、破膜剂和固定剂均购自Biolegend公司。Monensin为Merck公司产品。RPMI1640培养液购自Gibco公司。葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)购自上海华精生物科技公司。流式细胞检测仪(FC-500)及其流式结果分析软件CXP均为Beckman Coulter公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 外周血单个核细胞(PBMC)的获取 取正常人和PBC患者静脉血,肝素抗凝。PBS等倍稀释,充分混匀后等体积加到葡聚糖-泛影葡胺液面,离心(2 000 r/min,20分钟)。吸出PBMC后再充分洗涤(1 500 r/min,10分钟),最后用PBS调整PBMC密度为2×109L-1。

1.3.2 初始T细胞分选及纯度确定 取PBS+BSA+EDTA缓冲液重悬PBMC,严格按Miltenyi公司磁珠分选试剂盒说明书进行操作,经FITC-CD4和PE-CD45RA表面染色后行FCM检测,CXP软件分析表明,经免疫磁珠技术分选的初始T细胞纯度能大于98%。

1.3.3 细胞培养 将初始T细胞以1×109L-1的密度分4组培养在48孔培养板中,每组设2个复孔,每孔 500 μ l,培养第 1天起在各孔均加入 anti-CD3、anti-CD28和 anti-IL-4、anti-IFN-γ作为基础培养基后,4组再各自加入不同的细胞因子进行诱导培养:①不加任何细胞因子为空白对照组;②IL-1β组;③IL-1β+IL-6组;④IL-1β+IL-6+IL-23组。于37℃、50 mL/L CO2孵箱中进行细胞培养,隔3 d换液一次,并及时补充相应的细胞因子,培养9 d后在刺激剂PMA、Inomycin与monensin的刺激下继续培养4小时,收集培养后之细胞用于FCM检测。

1.3.4 流式细胞术检测 将上述收集的培养后细胞,离心洗涤(1 500 r/min,5分钟)制成细胞悬液,加入抗人FITC-CD4抗体表面染色,室温避光孵育30分钟,洗涤(1 500 r/min,5分钟),固定破膜,加入抗人PE-IL-17抗体胞内染色,室温避光孵育30分钟,离心洗涤(1 500 r/min,5分钟),cell staining buffer重悬后行FCM检测,CXP软件分析各自Th17细胞分化频率。

1.4 统计学分析 运用SPSS13.0软件统计包,所有数据用中位数(四分位间距)[M(Q)]表示,两组间比较采用Wilcox符号秩和检验,多组间比较采用Friedman秩和检验,多组间的两两比较采用Bonferroni法,检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 空白组 在仅加入 anti-CD3、anti-CD28和anti-IL-4、anti-IFN-γ培养时,正常人及PBC患者的初始T细胞向Th17细胞分化的频率均很低(＜1%)。

2.2 IL-1β组 在基础培养剂条件下加入IL-1β共培养时,经FCM检测发现:Th17细胞分化频率显著高于空白对照组,两组有显著性差异(P＜0.01)。

2.3 IL-1β+IL-6组 在基础培养剂条件下同时加入IL-1β和IL-6共培养后,Th17细胞分化频率明显高于未加细胞因子的空白对照组(P＜0.01);但IL-1β+IL-6组与IL-1β组间无统计学差异(P＞0.05)。

2.4 IL-1β+IL-6+IL-23组 在基础培养剂条件下将IL-1β、IL-6、IL-23同时加入后共培养,PBC患者初始T细胞分化为Th17细胞效果达到最佳,明显高于其它各组,差异有显著性差异(P＜0.01,见表1),PBC患者4组培养条件下Th17细胞分化FCM结果见图1。

图1 细胞因子对PBC患者初始T细胞分化为Th17细胞的诱导作用Fig.1 The effectiveness of different cytokines induce Na ïve T cells of PBC patients differentiating into Th17 cells

表1 不同细胞因子组诱导PBC患者Th17细胞分化[M(Q),n=15]Tab.1 The frequency of Th17 cells differentiation in PBC patients induced by different cytokines[M(Q),n=15]

表2 4种诱导条件下两组Th17细胞分化频率比较(M(Q),正常人n=20,PBC n=15)Tab.2 The frequency of Th17 cells differentiation between PBCpatients and normol induced under 4 conditions[M(Q),Normal n=20,PBC n=15]

2.5 PBC患者与正常人Th17细胞分化的差异PBC患者与正常人初始T细胞在相同条件下分组进行培养后,FCM检测,经CXP软件分析发现:IL-1β+IL-6+IL-23组促使正常人和PBC患者Th17细胞分化效果均达到最佳,但PBC患者Th17细胞分化效果明显高于正常人,两者有显著性差异(P＜0.01);但两组人群的 IL-1β组或 IL-1β+IL-6组,其初始T细胞向Th17细胞分化的效果均无统计学差异(P＞0.05),组间比较见表2。

3 讨论

由于IFN-γ在自身免疫疾病发病高峰期病变部位的高表达,使得分泌IFN-γ的Th1细胞被看作是引起自身免疫性疾病的关键因素。后发现IFN-γ缺陷性小鼠也具有对多种自身免疫疾病高度易感性,推测存在一种Th1以外的效应性T细胞介导了自身免疫疾病[7]。新近发现,有一群以分泌IL-17为特征的,不同于 Th1、Th2的 CD4+T细胞,即 Th17细胞,它由初始T细胞分化而来,并具有独立的分化和发育机制[8]。进一步研究发现,Th17细胞的分化受多种细胞因子调控。小鼠体外实验模型中,TGF-β和IL-6联用可诱导Th17分化[9]。也有报道称细胞因子IL-23能促进人Th17细胞的增殖并维持Th17细胞的活性[5]。

原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种自身免疫性胆汁淤积性肝病,以存在抗线粒体抗体和强烈胆管炎症反应为特征。与正常人相比,PBC患者肝组织Th17细胞显著增高,表明发炎的肝脏细胞微环境更易诱导Th17细胞的产生[4]。Annunziato等[10]发现IL-6能诱导Th17细胞分泌IL-17,与PBC发病密切相关。国外有报道称Th17细胞分化与多种细胞因子密切相关,特别是IL-1β、IL-6和IL-23等起到十分关键作用[5,6]。而细胞因子(IL-1β、IL-6与 IL-23)能否诱导PBC患者Th17细胞的分化,且不同细胞因子刺激下PBC患者Th17细胞分化是否有差异,尚未见报道。因此,我们着手研究PBC患者Th17细胞的分化条件及与正常人Th17细胞分化差异,观察这些细胞因子对PBC患者初始T细胞向Th17细胞分化的影响,以初步探讨Th17细胞分化与PBC疾病的潜在联系,为进一步揭示PBC的发病机理提供实验依据。

IL-1β是Th17早期分化关键的细胞因子,是Th17细胞及Th17细胞介导的自身免疫早期编程的关键T细胞信号[6]。本研究中,我们采用免疫磁珠分选技术(MACS)从PBC患者和正常人外周血中分选出初始T细胞,培养时各孔均加入T细胞分化抗体anti-CD3、anti-CD28和中和抗体anti-IL-4、anti-IFN-γ(阻断初始T细胞向Th1、Th2分化),并在加入不同细胞因子的条件下分组培养。发现未加入细胞因子的空白对照组Th17细胞分化频率很低(＜1%);而IL-1β组Th17细胞的分化频率明显增高,说明IL-1β显著促进Th17细胞的分化;与IL-1β组相比,IL-1β+IL-6组Th17细胞分化效果无统计学差异(P＞0.05),我们推测在诱导Th17细胞分化时,IL-6并未起到关键的作用。

IL-23对Th17细胞分化的影响,是近年来研究热点。但它在Th17细胞分化中的作用迄今尚未明确。IL-23是IL-12异二聚体细胞因子家族中的一员,除与IL-12一样拥有共同p40亚单元外还含独特的p19亚单元,IL-23通过IL-12Rβ1和IL-23R异二聚体受体复合物来发送信号。O'Donnell等[11]研究发现,IL-23可诱导Thl7细胞分化并分泌IL-17,在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)发病过程中起着重要作用。有研究称IL-23可能与Th17细胞增殖有关,并能为已分化的Th17细胞提供生存信号[8]。为探讨IL-23对Th17细胞分化的影响,我们将IL-1β、IL-6、IL-23一同加入培养液中,发现此组Th17细胞分化频率明显高于其他各组(P＜0.01),表明初始T细胞分化过程中,IL-23可能直接诱导Th17细胞分化,或在维持Th17细胞增殖中起重要作用,这与国外报道一致[4]。

我们将PBC患者与正常人的Th17细胞分化差异进行比较发现,IL-1β、IL-6联用或单独IL-1β诱导时,PBC患者与正常人Th17细胞分化无统计学差异(P ＞0.05),而在同时加入IL-1β、IL-6、IL-23诱导时,两者有显著性差异(P＜0.01)。研究还发现,与单独 IL-1β 或联用 IL-1β、IL-6 相比,IL-1β 、IL-6、IL-23 共同诱导时,无论是PBC患者还是正常人,其初始T细胞向Th17细胞分化效果均能达到最佳。且此时PBC患者Th17细胞分化效率明显高于正常人(P＜0.01)。

目前,关于PBC患者体内Th17细胞的过度增殖的确切机制尚不清楚。PBC作为一种自身免疫性肝病,是否其免疫异常可能是初始T细胞分化倾向发生改变,或者可能是PBC患者初始T细胞与正常人相比在基因上存在差别,还有待进一步的研究。我们期冀通过对PBC患者初始T细胞向Th17细胞分化诱导条件的研究,能为进一步探索Th17细胞和揭示PBC发病机制等的研究产生积极的作用。

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