骨髓基质干细胞诱导分化滑膜样细胞移植预防屈肌腱粘连的实验研究

利春叶 吴丽妮 朱肖奇 王爱琴 贾赛雄

(南方医科大学附属深圳宝安医院 广东深圳 518101)

1 动物实验材料、方法

1.1 实验动物

材料及仪器:新西兰大白兔90只,雌雄不限,5～7周龄,体重2.5kg左右,其中3只用于提供BMCS以及关节滑液来源,其余用于研究防止肌腱粘连。

1.2 研究方法

MSCs的诱导分化:将MSCs移入含地塞米松1×10-7mol/L、关节滑液1×10-7mol/L、bFGF-23ng/mL、维生素C100mg/L的胎牛血清DMEM,诱导MSCs向滑膜细胞分化,通过离心、纯化后鉴定(光镜、透射电镜以及免疫组化等鉴定)。然后培养扩增备用。

滑膜样细胞移植:选用84只大白兔,每只兔的右后肢作为实验组,左后肢为对照组。将诱导分化的细胞悬液移植入大白兔右后肢损伤的跟腱处,术后用管形石膏将下肢固定于膝关节屈曲15°,踝关节背伸l5°,足趾自然位。

检测指标:术后l、2、4、8周取材。第1周每组各3只动物6条跟腱进行大体标本粘连等级评定、组织学观察(包括光镜和透射电镜观察);后3周每组各6只动物12条跟腱,随机取6条跟腱进行生物力学测试,6条进行大体标本粘连等级评定及组织学观察。

表1 肌腱粘连分布(等级资料的秩和检验)

表2 肌腱的断裂载荷(单位:N)

2 结果

2.1 滑膜样细胞的鉴定

BMSCs传代培养初期可见大量悬浮细胞,48h后可见有散在纺锤形贴壁细胞,经多次半量换液后,未贴壁细胞逐渐被去除。4d后可见成簇、贴壁的纺锤形细胞逐渐增多,但仍存在混杂细胞。经多次传代后,细胞逐渐纯化,并且细胞初期多以集落形式增长,第6代后细胞呈形态均一的纺锤形,分布均匀。

在bFGF-2、关节滑液等诱导条件下,BMSCs逐渐向滑膜样细胞形态分化。于4d后散在个别细胞逐渐呈梭型生长。7d后梭型细胞较前增多,细胞间较少见紧密联接。10d时梭型细胞约占2/3。随细胞数量增加而逐渐紊乱,无明确的方向性排列特征。14d时长满培养皿底,细胞形态以梭形为主,两极胞突细长,末端多与邻近细胞连接并交织成网状。网间散布有较多小星形或多边形细胞,与梭形细胞紧密连接。

贴壁法纯化后,扩增培养,将纯化的梭型细胞用0.25%胰蛋白酶消化并吹打制成单细胞悬液,传代培养。传代细胞在48h内贴壁,并很快铺展。

2.2 大体标本屈肌腱粘连等级评定

Hitchcock[1]粘连分度法评估结果显示,随着愈合的发展,对照组肌腱粘连逐渐加重,实验组各时相粘连等级基本相当。同一时相点实验组同对照组相比粘连明显减轻(P＜0.05,见表1)。

2.3 跟腱生物力学测定

断裂载荷测试结果显示,实验组与对照组比较,断裂载荷有显著差异(P＜0.05),但与正常屈肌腱的断裂载荷比较,实验组和对照组均明显降低(P＜0.05,见表2)。

3 讨论

3.1 骨髓基质干细胞向滑膜样细胞的分化

骨髓基质干细胞是一种可多向分化的细胞,在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞和神经细胞等多种细胞。本研究表明,骨髓基质干细胞在关节滑液和FGF-2诱导下可以分化为滑膜样细胞,其具有成纤维细胞样滑膜细胞的组织学及超微结构特征,并且分化细胞免疫组化染色Vimentin阳性,CD68阴性。由于巨噬细胞样滑膜细胞不具有增殖能力,可通过多次传代去除巨噬细胞样滑膜细胞而获得较纯的成纤维样滑膜细胞[2]。这可能也是本实验中获得较纯的成纤维样滑膜细胞的原因。Vimentin(波形蛋白)是中胚层组织的特征性蛋白,主要存在于成纤维细胞和来自胚胎间充质的细胞。CD68是巨噬细胞的表面标志,我们用Vimentin及CD68单抗对培养的第三代滑膜细胞进行了鉴定,结果与上述文献相符。

3.2 滑膜样细胞移植预防肌腱粘连

早在1963年,Potenza[3]通过实验研究认识到保持肌腱滑膜鞘的完整,有利于减轻肌腱愈合过程中的粘连。实验组与对照组的跟腱粘连程度相比,实验组粘连程度较小,而且从观察时相开始到结束粘连程度相当,各时相点比较无统计学差异(P＞0.05)。此说明移植的细胞可有效防止肌腱粘连,并且可以促使滑膜形成及愈合,在光镜及扫描电镜下可以在肌腱周围形成一薄层交织成网状的滑膜样细胞层。国内张正治等[4]将取自兔的趾腱鞘内的滑膜细胞经原代和传代培养后,制成滑膜细胞悬液,再与自体无滑膜肌腱段联合培养。经扫描电镜观察,培养后的肌腱表面变得光滑,经免疫组化染色vimemtin阳性,说明肌腱表面有滑膜细胞覆盖,使之具有滑膜肌腱的形态学特征。这是与本实验相吻合的。

3.3 滑膜样细胞移植对肌腱强度的影响

虽然可以预防粘连,但肌腱达不到一定的抗张强度,也是万万不行的。滑膜样细胞移植后,肌腱的断裂载荷测试结果显示,实验组与对照组各时相数值比较,断裂载荷有显著差异,说明实验组肌腱愈合后生物力学强度较高。但与正常屈肌腱的断裂载荷比较,实验组和对照组均明显降低。虽然滑膜化肌腱抗张强度仍然达不到正常水平,但相比无滑膜肌腱有了很大提高。其中肌腱表面之滑膜在一定程度上增强了肌腱的抗张强度,而且滑膜分泌的滑液有营养作用,较之对照组促进了肌腱的更快愈合,也增强了肌腱的抗张强度。

[1]Hitchcock TF,Light TR,Bunch WH,et a1.The effect of immediate constrained digital motion on the strength of flexor tendon repairs in chickens[J].Hand Surg(Am),1987,12(4):590～595.

[2]Tomita T,Nakase T,Kanekom,et al.Expression of extracellular matrix met lop proteins inducer and enhancement of the preduction of matrix metal lop roteinases in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2002,46(2):373～378.

[3]Potenza AD.Critical evaluation of flexor-tendon healing and adhesion formation within artificial digital sheath[J].J Bone Joint Surg(Am),1963,45(6):1217～1233.

[4]张正治,刘正津,钟世镇,等.无滑膜肌腱滑膜化的组织工程学研究[J].生物医学工程杂志，2001，18(1)：1～4.