西葫芦灰霉病拮抗细菌XTB-108抗菌物质产生条件研究

张雪辉

（邢台学院生物化学系，河北邢台，054001）

西葫芦灰霉病主要是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinereaPers.）侵染引起的。该病原菌寄主广泛，可引起多种蔬菜、果树和花卉植物的灰霉病[1]，已成为设施蔬菜栽培的限制性障碍。生产上以化学防治为主，但由于农药大量长期的使用，不仅容易使病菌产生抗药性，还污染环境，对人畜造成了极大的为害。本研究旨在对该病的拮抗细菌的抗菌物质产生条件进行研究，旨在为开发生物农药提供理论基础，从而为西葫芦的绿色生产服务。

1 材料与方法

1.1 试验材料

拮抗细菌XTB-108由邢台学院生物化学系微生物实验室从污水中分离所得；西葫芦灰霉病菌（Botrytis cinerea），微生物实验室分离保存；PDA；LB培养基；LB培养液。

1.2 试验方法

①拮抗细菌母液的制备 将试管保存的菌种转接至LB培养基平板上活化，24 h后挑取一环接种于100 mL液体培养基中，摇床上30℃，180 r/min振荡培养24 h，制成5.2×108cfu/mL的悬浮液，称为母液。

②最佳发酵时间的测定 取母液7 mL加入到盛有100 mL LB培养液的三角瓶中，在30℃，180 r/min的条件下振荡培养， 分别在 0，8，16，24，32，40，48，56，64，72 h取出，离心过滤，采用牛津杯法进行生物测定[2]，每个牛津杯加入20 μL培养液，以无菌水作对照，在30℃下培养72 h，测定抑菌活性。

③不同接种量对发酵液抑菌活性的影响 将母液分别取 0.5，1，3，5，7，10，15，20，30 mL 接种于 100 mL的LB培养液中，摇床上30℃，180 r/min振荡培养48 h后取出，离心、过滤，测定无菌发酵液的抑菌活性（同②）。

④培养液初始pH值对发酵液抑菌活性的影响

将培养液用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH分别精确调 pH 值至 4，5，6，7，8，9，10，11， 经 121℃高压湿热灭菌30 min。取母液7 mL加入到盛有100 mL的LB培养液中，摇床上30℃，180 r/min振荡培养48 h，取出后离心、过滤，测定无菌发酵液的抑菌活性（同②）。

⑤培养方式对发酵液抑菌活性的影响 取母液7 mL加入到盛有100 mL的LB培养液中，设置静止、间歇振荡（12 h/d）和振荡（24 h/d，180 r/min）3 个处理，30℃培养，48 h后测定其无菌滤液的抑菌活性（同②），确定其最佳培养方式。

2 结果与分析

2.1 最佳发酵时间的测定

由图1可知，XTB-108菌株发酵液开始随着培养时间的延长抑菌活性逐渐提高，培养40~48 h其抑菌活性骤然升高，48h抑菌活性达到最高为64.67%，随后抑菌活性开始下降。所以最佳发酵时间定为48～56 h，以下培养时间均为发酵培养48 h。

表1 不同pH值对XTB-108菌株产生抗菌物质的影响

表2 不同培养方式对XTB-108菌株产生抗菌物质的影响

2.2 不同接种量在培养48 h时的抑菌活性

从图2可知，不同接种量对抑菌活性有一定的影响。在加入量为0.5~7 mL时，随着接种量的增加，发酵滤液的抑菌活性增高，加入7 mL时，抑菌活性达最高（64.32%），随后接种量越大，抑菌活性开始降低。所以本试验采用每100 mL培养基中加入7 mL母液的接种量为最好。

2.3 培养液初始pH值对XTB-108菌株发酵液抑菌活性的影响

由表1可以看出，发酵液的初始pH值对XTB-108菌株的发酵液抑菌活性影响较大。在pH值4～7时随着pH值的增大，抑菌活性增强，在pH值为7时抑制活性达到最大值，在pH值7～8时保持平稳，随后活性骤然降低。说明在酸性条件下不利于抑菌物质的产生，同时碱性过强直接影响着该菌的生长，也不利于抑菌物质的产生，只有在pH值7～8的弱碱性条件下才有利于产物活性成分的提高。

2.4 培养方式对XTB-108菌株发酵液抑菌活性的影响

由表2可见，培养方式对XTB-108菌株产生抗菌物质的影响较大。振荡培养有利于抗菌物质的产生，其无菌滤液对灰霉菌的抗菌活性 （抑菌率64.20%）高于间歇振荡培养（抑菌率47.50%）和静止培养（0%）。值得关注的是，静止培养的发酵液对灰霉菌无任何影响，表明该菌抑菌物质需要有充足的氧的供应才能产生。

3 小结与讨论

试验结果表明，在30℃，180 r/min振荡培养条件下，培养48 h，每100 mL LB培养液中接种发酵液母液7 mL，培养液的初始pH值为7～8时的培养基，是XTB-108产生抗菌物质的最佳条件。但该菌株是通过室内对峙培养和温室内西葫芦苗期生物测定筛选出的拮抗菌，对其抗菌物质产生条件也仅是通过室内摇瓶培养试验测得。还应进一步对其最佳防治剂量、最佳防治时间及最佳定植条件等进行研究，使得生产者在使用生防菌时，能科学施用，人为地调控田间及棚室的环境因素，充分发挥其生防潜能。

[1]韩兆均.植物保护学通论[M].北京：高等教育出版社，2001.

[2]李俊，纪明山，刘浩强，等.番茄灰霉病拮抗细菌R26抗菌物质产生条件的研究[J].沈阳农业大学学报，2004，35（2）：105-108.

[3]韩斯琴，徐梅，白震，等.番茄灰霉病拮抗菌D2-4发酵条件的研究[J].东北农业大学学报，2004，35（1）：93-98.