梨树内生拮抗细菌的筛选及发酵条件的研究

张宝俊,刘海涛,张家榕,韩巨才,刘慧平

(1.山西农业大学 农学院,山西 太谷 030801;2.山西农业大学生命科学院,山西太谷 030801)

梨树内生拮抗细菌的筛选及发酵条件的研究

张宝俊1,刘海涛1,张家榕2,韩巨才1,刘慧平1

(1.山西农业大学 农学院,山西 太谷 030801;2.山西农业大学生命科学院,山西太谷 030801)

以梨黑斑病菌(Alternaria alternata)为指示菌,从梨树木质部分离的8株内生芽孢杆菌中筛选出一株抑菌效果最佳的拮抗菌株LP5。为明确该菌株在发酵生产中的最佳营养组分及发酵条件,运用单因素试验和正交试验方法测定了不同因素下LP5菌株发酵液的OD600值及其抑菌作用。研究结果表明:最有利于菌体生长及抗菌物质积累的营养条件是以含蔗糖1.5%,蛋白胨1.0%,酵母粉0.5%,NaCl 0.5%的液体培养液,最适发酵条件为30℃,pH 7.0,发酵培养48 h～72 h。

梨黑斑病菌;内生细菌;发酵条件;正交试验

在利用植物内生细菌进行生物防治的研究中,以较低的成本获得较多的拮抗产物是进行大规模工业化生产的基础[1]。但由于生物菌体在发酵过程中受到营养成分、培养条件、环境因素等多方面因素的限制,常常难以发挥其潜在的生物学功能,为使生物菌体在发酵生产中能够分泌更多有益代谢产物,应当对其发酵条件进行优化。李景良等[2]通过对植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)ZJ316菌株的营养成分和发酵条件的优化,使该菌株产细菌素的能力提高了2.3倍。王端好等[3]通过对氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacter oxydans)发酵条件的优化,使该菌株的生物量比原条件下提高了50.6%,而且产生的脱氢酶比活力也有所提高。付莉等[4]通过对一株木醋杆菌(Acetobacter xy linum)发酵条件的优化,使细菌纤维素的产量提高了30%,生产成本由11.7元/kg下降到3.51元/kg,为细菌纤维素的工业化生产提供了科学依据。

本研究以梨树木质部分离的8株内生芽孢杆菌为研究对象,筛选出一株对梨黑斑病菌有较好抑制作用的菌株,并对其最适营养组分和发酵条件进行分析,目的在于使菌株最大程度上产生拮抗次生代谢物质,为菌株发酵产物的工业化生产提供试验依据,为深入开发和利用生防芽孢杆菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

内生芽孢杆菌LP1～LP8菌株采集于山西农业大学果园健康梨树侧枝的木质部,经分离纯化获得,梨黑斑病菌 (Alternaria alternata)为山西农业大学农药学实验室保存菌种。

1.1.2 供试培养基

基础培养液:酵母粉5 g;葡萄糖20 g;牛肉膏10 g;氯化钠5 g;水1 000 mL;PDA培养基:葡萄糖20 g;马铃薯 200 g;琼脂粉 18 g;水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗菌株筛选

对峙培养参照郭润芳的方法[5],在PDA平板中央接入直径 5 mm的梨黑斑病菌菌块,周围2 cm处接直径5 mm细菌菌体2块,25℃恒温培养5 d,测定菌体对梨黑斑病菌的抑制率,以不接细菌菌体为对照。

代谢产物活性检测:将各菌株接种于NA培养液中培养24 h获得种子发酵液,按照1%接种量将供试菌株接种于基础培养液中,28℃、150 r◦min-1振荡培养72 h,10 000 g离心10 min去除菌体,分两种方式处理发酵液,方法一:0.45 μ m微孔滤膜过滤灭菌;方法二:121℃湿热灭菌30 min。

采用生长速率法测定各菌株发酵液活性,将1 mL发酵液与9 mL PDA培养基混合制备平板,接入直径5 mm新鲜的梨黑斑病菌菌块,5 d后测定抑菌率,对照以无菌水替代发酵液。

1.2.2 最佳碳源筛选

以1.2.1中筛选的菌株为研究对象,以NA培养液活化菌株,按照1%接种量接种,分别以蔗糖、淀粉、甘露醇、乳糖、麦芽糖、果糖、木糖替换基础培养基中的碳源,于28℃、150 r◦min-1培养24、48、72 h后,测定不同碳源对菌体生长及抗菌物质积累量的影响。

1.2.3 最佳氮源筛选

以蛋白胨、尿素、硝酸铵、酵母、谷氨酸、甘氨酸、酵母+蛋白胨 (0.5∶1)、牛肉膏+蛋白胨(0.5∶1)替换基础培养基中的氮源,于28℃、150 r◦min-1发酵培养24、48、72 h后测定不同氮源对菌体生长及抗菌物质积累量的影响。

1.2.4 最佳培养条件分析

建立pH值、温度、N、C四因素三水平的正交试验,设九种组合方式。碳源分别设 1.5%、2.0%、2.5%三个含量;氮源分别设 1.0%、1.5%、2.0%三个含量;pH分别设5.0、7.0、9.0三个处理;温度分别设25、30、35℃三个处理,于150 r◦min-1发酵培养72 h后测定不同发酵条件下发酵液的OD600值及抑菌作用。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株筛选

经对峙培养检测,分离的8株内生细菌菌体对梨黑斑病菌抑菌率最高的为 LP4,抑制率达77.6%;其次为 LP1、LP3、LP5,抑制率均为77.4%,但与LP4菌株抑制率的差异不显著;LP2、LP6、LP7和LP8 4个菌株对梨黑斑病菌的抑制率在60%～70%之间,与LP4菌株抑制率的差异达到显著水平 (表1)。

表1 8个菌株对梨黑斑病的拮抗作用Table 1 Antagonism of 8 strains to Alternaria alternate

表1结果表明,8个菌株的次生代谢物质对梨黑斑病菌均有强烈的抑制作用。其中LP5菌株发酵液的抑菌效果最佳,对梨黑斑病菌的抑制率达92.6%,且发酵液灭菌处理后仍保留64.8%的抑菌活性 (表1),表明该菌株可能包括对热敏感的蛋白酶类和热稳定性较好的抗生素类等多种抗菌物质。综合分析细菌菌体及其代谢产物的抑菌活性,初步筛选出LP5为一株对梨黑斑病菌有拮抗作用的潜在生防菌株,后续发酵条件的优化以此菌株为研究对象。

2.2 最佳碳源及氮源的筛选

2.2.1 不同碳源对菌体生长及抗菌物质积累量的影响 (图1)

图1 不同碳源对LP5菌株菌体生长的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on growth of strain LP5

图1结果显示,以木糖为碳源时,发酵24、48、72 h,其发酵液的OD600值仅为 0.01、0.06、0.12,表明该菌株对木糖的利用率低,另7种碳源能明显提高菌体的生长,发酵48 h后发酵液OD600值在0.318～1.672之间,且发酵 48 h后发酵液OD600值显著高于24 h的OD600值,但与72 h时发酵液的OD600值差异不明显,表明24～48 h可能是菌体快速增长期。结果表明,碳源对菌体生长量的影响依次为麦芽糖＞蔗糖＞甘露醇＞乳糖＞葡萄糖＞淀粉＞果糖＞木糖。

碳源对抗菌物质积累量的影响依次为蔗糖＞麦芽糖＞甘露醇＞葡萄糖＞乳糖＞淀粉＞果糖＞木糖。发酵72 h后,发酵液对梨黑斑病菌的抑制率分 别 为 78.5%、67.7%、64.6%、53.3%、52.9%、40%、15.4%和0.9%,结果如图2所示。

图2 不同碳源对LP5菌株抗菌物质积累量的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on antagonistic substance of strain LP5

图2结果表明,麦芽糖对菌体的生长最为有利,但产生抗菌物质最多的是蔗糖,二者对菌体生长量的影响差异不显著,但对抗菌物质积累量的影响达到极显著水平 (组内F值为625.57**)

因此,综合考虑碳源对菌体生长和抗菌物质积累量二因素的影响,初步筛选出蔗糖为该菌株发酵的最适碳源。

2.2.2 不同氮源对菌体生长及抗菌物质积累量的影响 (表2)

表2 不同氮源对菌株生长和抗菌物质积累量的影响Table 2 Effect of different nitrogen sources on growth and antagonistic substance of strain LP5

结果表2表明,不同氮源对菌体生长和产抗菌物质的影响差异显著,以硝酸铵为氮源,发酵24 h、48 h、72 h后,菌体均不能生长,以尿素、谷氨酸、甘氨酸为氮源,菌体生长和抗菌物质积累量均很小,发酵72 h后OD600值仅为 0.028、0.057和 0.574,发酵液抑菌率分别为 13.9%、7.8%、17.8%,以酵母、蛋白胨、牛肉膏+蛋白胨、酵母+蛋白胨、酵母+牛肉膏为氮源,菌体生长和抗菌物质积累量均明显提高,72 h后发酵液OD600值均大于1.0,抑菌率大于50%。无以酵母+蛋白胨(0.5∶1)为氮源时发酵液OD600值和抑菌率均为最大值,分别为1.643和64.6%。因此,筛选出酵母+蛋白胨 (0.5∶1)为该菌株发酵的最适氮源。

2.3 不同发酵条件对菌体生长及抗菌物质积累量的影响 (表3)

表3 LP5菌株发酵条件正交试验因素水平结果Table 3 The result of orthogonal experiment of the strain LP5 fermentation condition

表3结果表明,初始pH值对LP5菌体生长及抗菌物质积累量的影响最为明显,1、8、9组合 (pH 5.0)中,菌体发酵培养72 h后的OD600仅为0.213、0.165、0.286,抑菌率低于5%。其余3因素对LP5菌体生长及抗菌物质积累量也有一定得影响。由R值分析表明,影响程度依次为pH、C源、N源和温度。正交分析结果表明,该拮抗菌株最适培养组分为含蔗糖1.5%、蛋白胨1.0%、酵母粉0.5%、NaCl 0.5%的液体培养液,最适发酵条件为30℃、pH 7.0时振荡培养48～72 h。

3 结论与讨论

芽孢杆菌作为一类潜在的生物农药资源已受到各国学者的广泛关注。目前包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡质芽孢杆菌 (Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌 (Bacillus lichenif ormis)、解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquef aciens)等多类芽孢杆菌已商品化。但为提高细菌杀菌剂防治效果、降低生产成本,需对生防菌的发酵条件进行优化,并建立适宜的工艺流程。目前,关于生防芽孢杆菌发酵条件的研究报道较多[6～8],如任争光等[9]研究发现,芽孢杆菌BJ-6产生抗菌物质的最适培养组分为含麦芽糖2%、蛋白胨1%、麸皮1%、CaCO31%、Na2HPO30.2%和KH2PO30.1%的培养液;发酵条件的30～35℃、起始pH 9.0、发酵培养60 h。王芳等[10]为提高拮抗菌株B36发酵生产的菌体量和抗菌物质的产率,通过单因子试验和正交试验方法,确定了最佳培养组成为含葡萄糖2.0%、酵母粉0.5%、大豆粉0.5%、NH4NO30.5%的液体培养液;最适发酵条件为28℃、pH 9.0条件下150 r◦min-1发酵培养36 h。杨华等[11]建立了1株苹果轮纹病拮抗细菌的最佳培养组成和培养条件,在含酵母浸膏0.5%、蔗糖2%、蛋白胨1%的液体培养液中28℃、pH 7.0,振荡培养96 h最有利于菌体生长,并且分析出菌体在酸性条件下 (pH 4.0)几乎不生长。本试验也测定出拮抗细菌LP5菌株在酸性条件下 (pH 5.0)菌体的生长量很小,与杨华等人的研究结果相近。

本试验以含菌量、抗菌物质的抑菌率两个指标分析了LP5菌株的发酵条件,研究表明该菌株的菌体生长量与其分泌抗菌物质的量存在一定的相关性,但不成正比,这与沈锦玉[12]的研究结果一致,因此要获得大量抗菌物质,应综合考虑菌体生长与抗菌物质分泌量间的关系。本研究仅从C源及N源含量、温度、初始pH四个主要方面分析了该菌株的发酵条件,通气量、接菌量、微量元素等因素对菌体生长及抗菌物质的分泌量的影响有待于进一步的研究。

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[3]王端好,薛小波,张小里.氧化葡萄糖酸杆菌的选育及其发酵条件优化 [J].西北大学学报,2009,39(2):237-240.

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Screening and Study on Fermentation Conditions of Endophytic Antifungal Bacteria Isolated from Pear Plant

ZHANG Bao-jun1,LIU Hai-tao1,ZHANGJia-rong2,et al.
(1.College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030801,China;2.College of Life Science,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030801,China)

WithAlternaria alternataas indicator,the strain LP5 was screened from eight strains of endophyticBacillus sp.,which were isolated from xylem of pear plant.To confirm the optimal components and cultural conditions of strain LP5,the antifungal activity and OD600of the strain LP5 were studied by the method of single factor and orthogonal design.Results showed that the optimal cultural liquid medium was composed of 1.5%sucrose,1.0%protein peptone,0.5%gyeast extract,0.5%NaCl,and the optimal fermentation conditions were 30℃,pH 7.0 and culturing for 48～72 h.

Alternaria alternata;Endophytic bacteria;Fermentation condition;Orthogonal design

S482.8

A

1671-8151(2010)01-0014-05

2009-09-07

2009-11-08

张宝俊 (1979-),男 (汉),山西新绛人,博士研究生,主要从事病虫害抗药性及生物农药方面的研究。

刘慧平,教授,硕士生导师。Tel:0354- 6288344;E-mail:sxndlhp@yahoo.com.cn

山西省留学归国基金 ( 2007061;2009043);山西省科技攻关项目 (2007031039);山西省研究生优秀创新项目(20093057)

(编辑:杨忠义)