老年和成年大鼠术后认知功能障碍模型的建立与比较

曹 剑,李 鹏,易 斌 ,罗铁山,石胜驰,陶国才

(第三军医大学西南医院麻醉科,重庆400038)

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是术后常见的并发症,研究报道中年患者接受手术后1周POCD发生率为19.7%,并有6.2%患者认知障碍持续到3个月以后[1],而老年患者 POCD的发生率更高,影响也更大[2]。对POCD病因及机制研究也成为科研热点,本实验拟通过观察经麻醉和手术处理后的大鼠学习和记忆能力的改变,旨在为制备和选择研究POCD发生机制的动物模型奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组 SD雄性老年大鼠(月龄22个月)30只,体质量500～600 g;SD雄性成年大鼠(月龄4个月)30只,体质量200～260 g,由成都达硕生物科技有限公司动物中心提供。老年大鼠随机分为3组(n=10):老年对照组(C1组),老年麻醉组(I1组),老年麻醉手术组(O1组)。成年大鼠随机分为3组(n=10):成年对照组(C2组),成年麻醉组(I2组),成年麻醉手术组(O2组)。

1.2 动物模型建立 采用自制透明麻醉吸入箱(用透明玻璃制成50 cm×40 cm×40 cm大小)实施吸入麻醉,麻醉箱一侧孔接Drager Fabius型麻醉机(德国 Drager公司),另一侧孔接solar 8000M型多功能监测仪(GE公司,美国),监测流出气体中麻醉气体浓度。麻醉组均进行1.5%异氟醚吸入麻醉2 h,麻醉箱中保持30%氧浓度。麻醉手术组大鼠在吸入箱中麻醉后迅速移入预充相同气体及吸入麻醉药的自制大鼠面罩内进行麻醉及手术,行右侧股动脉插管接多功能监护仪,腹部皮肤剪去毛发,消毒后取腹正中切口约5 cm进行腹腔探查术,依次探查肠道、肝、脾、肾等脏器,手术持续时间2 h。术中持续监测大鼠动脉血压、血氧饱和度、心率、呼吸、肛温,并给予腹腔加温生理盐水滴注补液及保温处理。术中0.5、1、2 h抽取动脉血进行血气分析。术中保持严格无菌操作,术后给予腹腔注射青霉素钠50 u/g,1次/天,预防感染,直至伤口完全愈合、拆线。对照组动物不进行任何处理。

1.3 动物学习及行为学测试

1.3.1 水迷宫实验 动物建模后1 d与对照组进行行为学测试,采用Morris水迷宫实验检测各组的空间学习记忆能力。将水池等分为四象限,在第四象限正中离池壁20 cm处放透明平台,平台顶低于水面2 cm。训练期间迷宫外参照物保持不变。(1)定位航行实验(place navigation test):实验历时5 d记录大鼠找到平台的时间,即逃逸潜伏期(escape latency),120 s找不到平台,潜伏期记为120 s。每次训练取四个象限平均值为当天成绩。(2)空间探索实验(spatial probe test):训练完毕次日进行空间探索实验,撤除平台,记录大鼠120 s内穿过原平台位置的次数和在原平台象限即第四象限探索时间作为空间记忆成绩[3]。

表1 各组大鼠水迷宫测试逃避潜伏期比较(n=10, ±s,s)

表1 各组大鼠水迷宫测试逃避潜伏期比较(n=10, ±s,s)

*:与C1组比较,P＜0.05;#:与I1组比较,P＜0.05;△:与C2组比较,P＜0.05;▲:与I2组比较,P＜0.05。

组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天C1组 52.34±10.21 22.53±6.43 10.76±2.42 10.35±3.52 9.32±2.53 I1组 54.65±12.14 28.42±5.14* 18.51±3.67* 14.79±2.27* 13.17±3.65*O1组 53.32±10.64 33.72±5.69* 22.65±3.52* 18.42±3.52*# 17.26±5.18*#C2组 52.25±13.33 21.99±6.52 9.32±2.25 8.62±2.55 7.42±2.91 I2组 54.63±17.43 22.87±6.21 11.61±3.39 9.19±2.61 8.25±2.39 O2组 57.51±17.92 25.53±6.04△ 18.37±3.28△▲ 16.65±4.63△▲ 14.67±3.73△▲

1.3.2 电脑控制的穿梭箱系统 本系统以灯光为条件刺激,足底电击为非条件刺激。大鼠在接受灯光刺激后即能进行穿梭运动为主动回避反应(active avoidance reaction,AAR),如需进行电击而完成穿梭称为被动回避反应(passive avoidance reaction,PAR)。按参照文献[4]进行训练5 d,每次进行20轮光电刺激,动物先在暗箱内适应5 min,开始时给予持续灯光刺激5 s,如大鼠不逃至另一端,则给予电击(电流3 mA、频率15 Hz),使动物逃至箱底不通电的另一端,此时电击停止,否则持续受电击5 s。间隔60 s重复上述刺激。分别在麻醉、手术处理后第5天,1、2、4周进行穿梭箱实验测试。大鼠的学习记忆能力以完成AAR的次数与测试总次数的比值即AAR比率代表[5]。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析处理。数据以±s表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)以及Post Hoc Tests多重比较检验(multiple Comparisons)法。

2 结 果

2.1 术中情况 两组大鼠术中生命体征平稳,未发现低血压、缺氧、二氧化碳储留及酸碱平衡紊乱。

2.2 水迷宫试验结果 与C1组比较,I1组与O1组手术后在训练第2天均开始出现逃逸潜伏期延长(P＜0.05),并持续到训练测试结束,而O1组在训练第4天及测试当天逃逸潜伏期长于I1组(P＜0.05)。I2组逃逸潜伏期与C2组比较未见显著差异,从第2天开始O2组表现出逃逸潜伏期延长(P＜0.05)(表1)。空间探索实验显示:与C1组比较,I1组穿越平台次数减少(P＜0.05),O1组探索时间及穿越平台次数均减少(P＜0.05)。I2组与C2组比较未见明显差异,但O2组探索时间及穿越平台次数均较C2、I2组减少,差异有统计学意义(P＜0.05),见表 2。

表2 各组大鼠空间探索实验结果比较(n=10, ±s)

表2 各组大鼠空间探索实验结果比较(n=10, ±s)

*:与C1组比较,P＜0.05;△:与 C2、I2组比较,P＜0.05。

组别 空间探索时间(s)穿越平台次数(次)C1组 48.55±6.92 7.15±2.50 I1组 46.94±7.23 5.30±2.17*O1组 37.28±6.27* 4.14±2.30*C2组 57.53±12.51 8.60±2.21 I2组 54.23±11.52 7.80±2.27 O2组 45.32±10.74△ 3.50±1.77△

2.3 穿梭箱测试结果 与C1组比较,I1组第5天时主动回避率降低。O1组直至第2周仍较C1组低,第4周未见明显差异。I2组各时相点与C2组比较未见明显差异,但O2组与C2组比较第5天及1周时差异有统计学意义(P＜0.05),见表3。

表3 各组大鼠实验因素处理后各时相点AAR结果(n=10, ±s,%)

表3 各组大鼠实验因素处理后各时相点AAR结果(n=10, ±s,%)

*:与C1组比较,P＜0.05;#:与 I1组比较,P＜0.05;△:与 C2、I2组比较,P＜0.05。

组别 第5天 1周 2周 4周C1组 92.43±7.26 92.35±6.53 89.43±8.32 90.41±6.50 I1组 83.27±6.14* 87.42±5.14 88.36±5.62 87.42±8.08 O1组 70.32±10.26*#78.76±6.39*#81.53±6.17*#86.82±4.72 C2组 93.24±4.62 91.99±6.42 88.31±4.29 89.62±6.55 I2组 90.32±5.43 89.59±6.85 88.61±4.09 88.49±4.08 O2组 76.11±9.12△ 80.51±6.93△ 85.84±5.18 86.04±4.06

3 讨 论

POCD在临床并不少见,随着社会老龄化加剧,接受麻醉与手术的老年患者比例增加,POCD发生率也呈上升趋势。关于POCD发生率各研究报道不一,但毋庸置疑的是POCD的发生不仅延长住院时间、增加费用支出、同时增高发病率及病死率[6]。关于术后认知功能的研究也成为科研热点,然而POCD的发生机制仍然不明确,目前认为有多种因素与POCD的发生相关,如麻醉方法、麻醉药、手术类型、基础健康状况、并发症、缺氧、低血压、年龄、基础认知能力及基因差异等。但目前较明确的是POCD在老年患者发生率较高[2]。研究报道术中应用吸入麻醉药异氟醚后对术后认知功能影响明显[7],而临床报道腹部手术后POCD较常见,因此本研究应用异氟醚麻醉大鼠并进行剖腹探查术,尽可能模拟临床手术麻醉过程,术后通过行为学检测评价处理因素对大鼠认知功能的影响。

由于低血压、感染以及术中缺氧等因素可能影响POCD的发生[8],因此本研究进行了血压、心率、血气及体温监测,以排除其他因素干扰,术后给予抗生素防止伤口感染。Morris水迷宫是一种研究与学习记忆功能直接相关的测试方法,逃逸潜伏期直接反映了空间信息获取的学习能力,空间探索实验反映了记忆储存及提取再现的能力。而穿梭箱实验以光、电击为联合刺激,使实验动物由被动回避建立主动的条件反射。记录此条件反射建立过程中的AAR指标可反映实验动物的学习、记忆能力的变化。本实验结果显示,在成年大鼠中,麻醉并没有对大鼠认知能力产生明显影响,而老年大鼠却表现出认知能力下降,但在1周时并未见与对照组存在差异,说明异氟醚对老年大鼠的认知功能影响随时间延长逐渐减小。麻醉手术后大鼠均出现认知能力下降,老年大鼠尤为明显,并且持续时间较长,说明手术创伤应激在POCD中发挥了重要的作用。既往研究也报道了腹部手术后大鼠认知功能下降[9],而研究报道局部麻醉与全身麻醉后POCD的发生率并未有明显的差别,同样提示了POCD发生机制与手术创伤的关系[10]。本实验结果表明异氟醚吸入麻醉和剖腹探查手术引起的术后认知能力下降在不同年龄大鼠中表现出不同的影响,而尤其以手术对认知功能影响较大,同时老年大鼠更易发生认知能力损害。

综上所述,本研究通过模拟临床麻醉、手术过程,成功构建了术后认知功能损害的大鼠模型,并比较了麻醉手术对成年和老年大鼠认知功能影响的差别,为今后研究POCD发生机制奠定了一定基础。由于POCD发生机制比较复杂,就目前研究水平来看,POCD的模型建立尚缺乏一个标准的处理方法及评价金标准,目前国内外学者倾向于通过动物组间行为学差异来认定认知能力的下降,而建立一个公认的标准化处理方案及判断金标准仍然是努力的方向。

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