黄蒲通窍胶囊对拟血管性痴呆大鼠神1经)细胞c-fos、c-jun蛋白表达的影响

刘 妮,谢道俊,曹仕健,陈永华,江停战,汪远金,

胡业彬,李之和,黄 为,尹良胜,王莉莉

脑缺血后神经细胞凋亡的发生机制尚未完全明了,可能与脑缺血再灌注时氧自由基增多、钙超载及兴奋性氨基酸释放有关,但更重要和更直接的是凋亡细胞内活跃的基因表达。原癌基因尤其是c-fos和c-jun在细胞生长调节和胞内信号传递分泌中具有极为重要的作用。细胞凋亡控制基因在脑缺血损害中参与凋亡的发生,升高的c-fos和c-jun参与神经细胞凋亡[1]。本研究基于脑缺血再灌注损伤后的血管性痴呆(VD)大鼠模型,探讨中药黄蒲通窍胶囊对VD大鼠学习记忆相关基因,同时也是神经细胞凋亡相关调控基因c-fos和c-jun的影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验于2004年5月在安徽中医学院第一附属医院实验中心进行。选用健康成年雄性Wistar大鼠100只,体质量(300±20)g,由河南医科大学实验动物中心提供,合格证号:豫医动字410157号。

1.2 药物及试剂 黄蒲通窍胶囊(主要由人参、大黄、益智仁等组成)由安徽中医学院第一附属医院提供,批号:20030816,0.4 g,实验前将黄蒲通窍胶囊内粉溶于蒸馏水中,配成0.084 g/mL的浓度;都可喜(Duxil,每片含阿米三嗪30 mg及萝巴新10 mg):法国施维雅(SERVIER,批号:2M0153)药厂,溶于蒸馏水中,配成0.7 g/mL浓度的溶液,冰箱保存。c-fos和 c-jun多克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物公司。

1.3 主要仪器 电子天平FA2104MAX210型由上海仪器厂生产;S◦C202型电热恒温干燥箱由浙江省嘉兴市新腾电器厂生产;KDC-2046低速冷冻离心机。

1.4 干预措施 参照 Nagasawa等[2]和Zea Longa等[3]的方法加以改进制作线栓法大脑中动脉栓塞模型。阻断该侧大脑中动脉的血流导致脑缺血。再次结扎入口处,尼龙线外留约1 cm,缝合皮肤。2 h后轻轻提拉所留线头至有阻力实现大脑中动脉再灌,则造模完成。假手术组手术过程同上,插线深度为1.5 cm。正常组大鼠不作任何手术处理。所有手术动物缝合前切口处涂上庆大霉素溶液,术后肌肉注射青霉素2×104U/100 g,1次/日,连续3 d以预防感染。购买后适应性饲养1周,然后开始造模。术前、术后各禁食12 h,术后保温饲养。

1.5 分组及处理 于缺血2 h～6 h内观察动物的躯体感觉和动物功能,按Zea Longa[4]5分制为神经病学评分标准评分:0分,无神经损伤症状;1分,不能完全伸展对侧前或后爪;2分,向手术对侧转圈;3分,向手术对侧倾倒;4分,不能自发行走,意识丧失。1分(包括 1分)以上为造模成功,低于1分则未成功,弃去。

各组动物分组如下:空白组15只;假手术组15只。余下70只全部造模,随机选取造模成功大鼠45只,按随机数据表分成3组,每组15只,即模型组、中药组(黄蒲通窍胶囊组)、阳性对照组(都可喜组)。中药组:按临床成人剂量的7倍给药,即0.42 g/kg。按照大鼠体质量以0.01 ml/g的剂量灌胃给药。阳性对照组,按照大鼠体质量以0.01 ml/g的剂量灌胃给药。空白组、假手术组和模型组与中药组和阳性对照治疗组同时予以蒸馏水灌胃,按照大鼠体重以0.01 ml/g的剂量灌胃。各组大鼠造模结束第 2天开始给药,1次/日,连续处理28 d。

1.6 组织处理 断头取脑,除去小脑和脑干,取缺血侧半脑,从视交叉处冠状面切开,放入相同的固定液中固定1周,制作脑部冠状切片。

1.7 观察指标 c-fos、c-jun免疫组化染色,用博士德公司推荐的SABC法。在额顶叶皮质,相近部位同倍的6个不同视野,统计上述3组指标的阳性细胞数、阳性细胞数占总细胞数的比率以及阳性细胞的着色深浅度,取平均值。阴性对照采用正常山羊血清替代第一抗体进行。

2 结 果

2.1 黄蒲通窍胶囊对大鼠脑组织c-fos的影响(见表1)

表1 各组大鼠脑组织c-fos的表达(±s)

表1 各组大鼠脑组织c-fos的表达(±s)

组别 阳性(个)比例(%)着色深浅(分)空白组 55.33±2.74 78.93±1.29 3假手术组 58.34±3.16 80.56±2.43 3模型组 76.17±1.983) 83.62±2.013) 4中药组 94.33±3.342) 93.85±1.962) 4都可喜组 91.50±2.262) 89.32±2.221) 3与模型组比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01;与空白组比较,3)P＜0.01

2.2 黄蒲通窍胶囊对大鼠脑组织c-jun的影响(见表2)

表2 各组大鼠脑组织c-jun的表达(±s)

表2 各组大鼠脑组织c-jun的表达(±s)

组别 阳性(个)比例(%)着色深浅(分)空白组 56.50±2.24 67.06±2.22 3假手术组 64.56±3.12 69.86±1.86 3模型组 65.83±2.482) 78.36±1.232) 3中药组 83.67±1.981) 91.11±1.731) 3都可喜组 81.33±2.361) 87.32±2.041) 3与模型组比较,1)P＜0.01;与空白组比较,2)P＜0.05

3 讨 论

脑内神经细胞的信息传递经跨膜传导机制,激活细胞内第二信使系统,在引起细胞瞬时反应的同时,可激活第三信使,引起基因转录变化即刻早期基因c-fos及其所编码的蛋白可作为核内第三信使,在神经信号的传递过程中起重要作用,它能将外界短时程的传入信号和长时程的基因表达偶联起来,调控神经细胞的多种后期效应基因表达,从而使神经细胞的可塑性及兴奋性发生改变[4]。在正常情况下,c-fos在神经系统的表达很低,参与细胞生长、繁殖、分化、信息传递和人的学习、记忆等生理过程。生理性刺激和病理情况下均能短暂地诱导细胞内c-fos表达。脑缺血是即早基因强有力的诱导剂,近年的研究表明,脑缺血导致c-fos表达呈两种方式:短暂而快速的表达[5,6],延迟的表达[7]。

c-jun与 c-fos关系密切,外界刺激后,fos和jun的mRNA可短暂地在胞浆内积累,并翻译出相应的蛋白质fos和jun,跨核膜转入核内,二者通过亮氨酸拉链形式构成1∶1异源二聚体,是fos和jun的活性形式,可与靶基因上调节区(AP1位点)结合,影响靶基因表达。已有报道,抗c-jun的低聚核苷酸可以一种程序特异性的方式影响学习记忆过程,提示c-jun在学习记忆过程中具有特异性作用[8]。

用T UNEL法在缺血侧基底皮层与丘脑可见凋亡细胞,梗死中心的尾壳核只见少量散在凋亡细胞。免疫组化测得缺血侧皮层与丘脑c-fos表达性增高,非梗死区的扣带回皮层也见大量c-fos。张玲等[9]研究证实,脑缺血及再灌注损伤可诱导c-fos基因的表达,且在相同脑区内见到细胞凋亡,表明c-fos表达在细胞凋亡中可能起一定作用。国内尚有研究结果显示脑缺血再灌注损伤可诱导c-fos和c-jun蛋白的表达,且表达区域与细胞凋亡一致,主要位于半暗带区,提示c-fos和c-jun的表达可能在脑缺血再灌注导致细胞凋亡的过程中起一定作用[10]。脑缺血后c-fos基因在神经细胞内的高表达和神经细胞凋亡关系密切。然而c-fos基因高表达在脑缺血及缺血再灌注后神经细胞凋亡中的作用机制尚未明了,两者间的关系也存在许多争议[11]。c-fos表达后的 Fos蛋白具有双重效应,既可介导细胞凋亡,又能参与细胞损伤后的修复。Kamme等[12]在观察低温对脑缺血后神经元的影响时提出低温可影响c-fos的表达,并可能干扰脑缺血后神经细胞凋亡的进程。王雪等[13]也提出以c-fos基因的双效假说,认为在神经细胞系统修复/防御系统完全被抑制时,c-fos参与凋亡,未被抑制时参与神经细胞的损伤后修复。

关于脑缺血后c-fos的表达与学习记忆之间的关系,Shigeno等[14]通过对脑缺血后海马、下丘脑神经细胞中 NGFmRNA、c-fosmRNA的观察,揭示c-fos可能通过上调脑缺血损伤区的NGF基因表达,使脑缺血后海马、下丘脑区的神经细胞NGF量增加,从而延迟和部分抑制了该区域的细胞凋亡进程。利用反义核酸技术抑制脑内c-fosmRNA的表达,发现c-fosmRNA对大鼠Y迷宫的学习行为没有影响,但大鼠分辩记忆的保持能力却明显减弱,证实转录因子c-fos与长期记忆有关[15]。包新民等[16]用Y迷宫证明大鼠全脑缺血5 d后,学习记忆能力显著降低,同时观察到纹状体边缘区内的神经元明显缺失,c-fos蛋白一过性表达增高,提示全脑缺血后导致的海马以及边缘区等在内的神经元损伤,可能是造成全脑缺血后学习记忆功能障碍的原因。张雪朝等[17]通过对VD大鼠的针刺干预研究,推测针刺脑、肾耳穴后,可能加强了c-fosmRNA及蛋白在海马CA1区的表达。

本组资料结果显示,脑缺血4周后模型组大鼠c-fos和c-jun有一定的表达,中药组大鼠c-fos和c-jun的表达明显增强,提示黄蒲通窍胶囊一方面可能通过上调脑缺血后某些抑制凋亡基因的表达,延迟和抑制了脑缺血后细胞凋亡的进程,而起到脑保护的作用;另一方面表达增强的Fos蛋白可能作为细胞核的第三信使,启动和调控某些与学习记忆功能相关的基因,最终起到改善VD大鼠学习记忆障碍的作用。

黄蒲通窍胶囊具有脑保护和改善VD大鼠的学习记忆能力的作用,其确切的机制尚不清楚。但本方的现代药理学研究证实,人参大补元气,人参皂甙Rg-1能选择性增强老年大鼠免疫功能,改善老年大鼠的行为活动和操作能力,提高青、老年大鼠海马神经细胞功能,促进海马细胞内c-fos基因的表达,并对抗谷氨酸介导的神经毒作用以及对原代培养的大鼠海马神经细胞表现出一定的保护作用[18]。石菖蒲豁痰开窍,为治疗痰蒙清窍之首品,《本经适源》谓之可“开心孔,通九窍,明耳目,出声音,总取辛温利窍之力”。药理学研究表明石菖蒲对痴呆大鼠学习记忆具有改善作用,其机制可能与石菖蒲的神经元保护作用及突触可塑性有关[19]。石菖蒲挥发油尤其是β-细辛醚有抑制大鼠神经细胞凋亡的作用[20]。石菖蒲提取物在多种实验中有改善学习记忆障碍的作用,并能降低乙酰胆碱酯酶活力,增强c-jun基因表达[21]。这些可能是黄蒲通窍胶囊治疗VD的重要机制。

[1]Gillardon F,Lenz C,Waschke KF,et al.Altered expression of bcl-2,bcl-x,bax and c-fos colocalizes with DNA fragenttation and ischemic cell damage following middle cerebral artery occlusion in rats[J].Mol Brain Res,1996,40:254-260.

[2]Nagasawa H,Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion[J].Stroke,1989,20:1037-1043.

[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4]T eskey GG,Atkinson BG,Gain DP.Expression of the proto-oncogene c-fos following electrical kindling in the rat[J].Brain Res Mol Brain Res,1991,11(1):1-6.

[5]Ikeda J,Nakajima T,Osborne OC,et al.Coexpression of c-fos and hsp70 mRNAS in gerbil brain after ischemia:Induction threshold,distribution and time course evaluated in situ hybridization[J].M ol Brain Res,1994,26:249-258.

[6]Kiessling M,Stumm G,Xie Y,et al.Differential transcription and translation of immediate early genes in the gerbil hippocampus after transient global ischemia[J].Cereb Blood Flow Metab,1993,13(6):914-924.

[7]Uemura Y,Kowall NW,Moskowitz A.Focal ischemia in rats causes time-dependent expression of c-fos protein immunoreactivity in widespread regions of ipsilateral cortex[J].Brain Res,1991,552:99-105.

[8]李国珍,胡俊峰.学习记忆相关基因在职业性损害机制研究中的应用[J].中华预防医学杂志,2002,36(1):63-64.

[9]张玲,杨益阶,余绍祖,等.大鼠局灶性脑缺血时细胞凋亡与c-fos表达[J].卒中与神经疾病,2000,7(2):71-74.

[10]周珂,李庚山,余绍祖.脑缺血再灌注损伤时c-fos、c-jun的表达和细胞凋亡[J].卒中与神经疾病,2003,10(1):3-6.

[11]Cho S,Park EM,Kim Y,et al.Early c-fos induction after cerebral ischemia:A possible neuroprotective role[J].J Cereb Blood Flow Metab,2001,21(5):550-556.

[12]Kamme F,Campbell K,Wieloch T.Biphasic ex pression of the fos andjan families of transcription factors following transient forebrain ischaemia in the rat.Effect of hypothermia[J].Eur J Neurosci,1995,7:2007-2016.

[13]王雪.神经细胞的生理和病理过程与原癌基因c-fos的关系[J].国外医学:生理病理科学与临床分册,1998,18(4):358-361.

[14]Shigeno T,Miwa T,Takakura K,et al.Amelioration of delayed neuronal death in the hippocampus by nerve growth factor[J].J Neurosci,1991,11:2914.

[15]Grimm R,Schicknick H,Riedel,et al.Suppression of c-fos induction in rat brain impairs retention of a brightness discrimination reaction[J].Learn Mem,1997,3:402-413.

[16]包新民,舒斯云,曾建新.全脑缺血后大鼠纹状体边缘区原癌基因c-fos的表达及其对学习记忆功能的影响[J].第一军医大学学报,2001,21(10):724-727.

[17]张雪朝,吕明庄,贺志光,等.针刺对VD大鼠记忆障碍及c-fosmRNA和蛋白表达的影响[J].中国康复医学杂志,2001,16(2):74-76.

[18]刘忞.人参皂甙Rg-1抗衰老和促智作用及其机制研究[J].生理科学进展,1996,(2):139-141.

[19]景玉宏,冯慎远,汤晓琴.石菖蒲对学习记忆的影响及突触机制[J].中国中医基础医学杂志,2002,8(6):38-40.

[20]方永奇,匡忠生,谢宇辉,等.石菖蒲对缺血再灌注脑损伤大鼠神经细胞凋亡的影响[J].现代中西医结合杂志,2002,11(17):1647-1649.

[21]吴宾,方永奇.石菖蒲益智作用的物质基础及其机理研究[J].中医药学刊,2004,22(9):1635-1640.