泽兰对人冠状动脉平滑肌细胞增殖的影响1)

聂 波,李佳彦,王硕仁,朱陵群,孙逸坤,崔 巍,牛福玲

泽兰是一味传统的活血化瘀中药,为唇形科植物毛叶地瓜儿苗(Lycopus lucidus Turcz.var.hirtus Regel)的干燥地上部分,具有活血化瘀、行水消肿的功能[1]。目前,地瓜儿苗与毛叶地瓜儿苗临床上均做泽兰使用。以往的研究显示:泽兰具有抑制多种细胞增殖的作用,包括人成纤维细胞[2]、SPC-A-1人肺腺癌细胞[3]、人肝癌细胞(HepG2)和人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)[4]等。但是关于泽兰是否具有抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖的作用尚不清楚。VSMC异常增殖在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)病变发生过程中起关键作用。有效地抑制VSMC增殖以阻断动脉粥样硬化(AS)进程具有重要的理论和临床意义。因此,本研究以中药泽兰为研究对象,于体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞(human coronary artery smooth muscle cells,HCASMC)上,观察泽兰水提物和乙醇洗脱物对该细胞的增殖和细胞周期的影响,以探讨泽兰抗动脉粥样硬化的药理作用,为动脉粥样硬化创新药物开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 HCASMC(美国Cascade公司),每管含有 5×105个活细胞,系传代培养至第三代后冻存所得。保存于液氮中。

1.2 药物 泽兰产于河北白洋淀,于2007年4月采集,由北京中医药大学鉴定为唇形科植物地瓜儿苗。用水提取,过滤,浓缩,离心除蛋白,冷冻干燥,得水提液干粉(LLST)。水提液浓缩后上AB-8大孔树脂柱,水洗后,用95%的乙醇洗脱,收集95%乙醇洗脱液,冷冻干燥,得95%乙醇洗脱液干粉(LLCX)。

1.3 试剂 大孔树脂AB-8(河北沧州保恩化工有限公司,药用级);M231基础培养基(美国Cascade公司)。平滑肌细胞生长补充剂(SMGS,美国Cascade公司。胰酶/EDTA(美国 Gibco公司);RNA酶A和M TT均购自美国Sigma公司。

1.4 仪器 FD-1D-80℃冷冻干燥机(北京博医康);128C-400自动酶标仪(奥地利,Clinicbio);LD5-2B低速离心机(北京雷勃尔离心机公司);FACSCalibur流式细胞仪(美国 BECTON DICKINSON公司);IMT-2倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.5 细胞的复苏与传代培养 取出含有HCASMC的冻存管,37℃水浴解冻,混匀,稀释成浓度为1.25×104个/mL的细胞悬液,种入75 cm2培养瓶中,每瓶加入细胞悬液15 mL,摇匀。将培养瓶置于37℃,5%CO2的培养箱中。在细胞复苏后24 h到36 h之间换液,之后每48 h换液一次。至细胞长至80%时,以胰酶消化,传代,进行传代培养。

1.6 细胞增殖抑制实验(MT T比色法)取培养第6～8代HCASMC,调整细胞密度至1×104/mL,以每孔100 μ L接种于96板,培养24 h,待细胞生长成融合状态时,随机分组:空白组、不同浓度泽兰 LLST 组(320 μ g/mL、640 μ g/mL、1 280μ g/mL 、2 560μ g/mL、5 120μ g/mL)和不同浓度泽兰 LLCX(40μ g/mL、80 μ g/mL、160 μ g/mL 、320 μ g/mL 、640 μ g/mL)。 每组 设 6 个复孔 ,继续培养2 4 h后,每孔加入2 0μ L MT T溶液(5 mg/mL),置37℃,5%CO2培养箱中继续培养4 h,终止培养,吸弃孔内上清液,每孔加入 150 μ L DMSO,震荡10 min在 492 nm波长下测定各孔OD值。

1.7 流式细胞仪分析细胞周期和DNA合成 取培养第6～8代HCASMC,调整细胞密度至 1.5×105/mL,将细胞接种于 6孔板,培养24 h,观察待细胞长成融合状态时,随机分组:空白组、不同浓度泽兰LLST给药组,继续培养24 h后,以0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA-Na2等量混合配比的消化液消化HCASMC,制备单细胞悬液,流式细胞仪测定细胞周期变化。

1.8 统计学处理 采用SPSS 11.5统计分析软件,均数间经方差齐性检验后,数据以均数±标准差(±s)表示。统计方法选用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 泽兰LLST和LLCX对HCASMC增殖的影响

2.1.1 泽兰LLST对HCASMC增殖的影响 在药物作用24 h后,MT T结果显示各药物剂量组与空白组比较均有统计学意义(P＜0.05),显示良好的抑制增殖的作用;当药物浓度为320 μ g/mL,640 μ g/mL,1 280 μ g/mL 时 ,三者不能呈良好的线性关系;当药物浓度为2 560 μ g/mL,5 120 μ g/mL时,OD值显示两者接近于半数致死量,显示该药物具有一定的毒性。详见表1。

表1 不同浓度泽兰L LST对HCASMC增殖的影响(±s)

表1 不同浓度泽兰L LST对HCASMC增殖的影响(±s)

药物剂量 n OD值空白 6 0.314±0.063 320 μ g/mL 6 0.234±0.0151)640 μ g/mL 6 0.226±0.0131)1 280 μ g/mL 6 0.248±0.0171)2 560 μ g/mL 6 0.176±0.0351)5 120 μ g/mL 6 0.128±0.0661)与空白组比较,1)P＜0.05

2.1.2 泽兰LLCX对HCASMC增殖的影响 在药物作用24 h后,MT T结果显示各药物剂量组与空白组比较均有统计学意义(P＜0.05),显示良好的抑制增殖作用;当药物浓度为40 μ g/mL,80 μ g/mL,160 μ g/mL 时,三 者不能呈良 好的线 性关系;当药物浓度为 320 μ g/mL,640 μ g/mL时,OD 值显示两者接近于半数致死量,显示该药物具有一定的毒性。详见表2。

表2 不同浓度泽兰LLCX对 HCASMC增殖的影响(±s)

表2 不同浓度泽兰LLCX对 HCASMC增殖的影响(±s)

药物剂量 n OD值空白 6 0.294±0.028 40 μ g/mL 6 0.200±0.0221)80 μ g/mL 6 0.190±0.0121)160 μ g/mL 6 0.215±0.0521)320 μ g/mL 6 0.179±0.0341)640 μ g/mL 6 0.143±0.0301)与空白组比较,1)P＜0.05

2.2 泽兰LLST和LLCX对HCASMC细胞形态学的影响与空白组相比,随着泽兰LLST和LLCX浓度的增加,细胞数目逐渐变少,当浓度达到1 280 μ g/mL和 160 μ g/mL时,部分细胞由星形的丝状细胞变为方形或三角形的细胞,当浓度达到2 560 μ g/mL和320μ g/mL时,死细胞数目增加;浓度达到 5 120 μ g/mL和5 640 μ g/mL时,死细胞明显增加,细胞严重变形。

2.3 泽兰LLST和LLCX对HCASM细胞周期的影响

2.3.1 泽兰LLST对HCASM细胞周期的影响(见表3)

表3 不同浓度泽兰水提物(LLST)对HCASM细胞周期的影响(±s)%

表3 不同浓度泽兰水提物(LLST)对HCASM细胞周期的影响(±s)%

药物剂量 n G0/G1 S G2/M apoptosis空白 3 71.12±1.88 20.37±2.12 8.51±1.02 0.62±0.42 320 μ g/mL 3 73.03±1.46 16.95±1.601) 10.12±0.36 0.60±0.47 640 μ g/mL 3 76.81±1.43 14.33±1.331) 9.06±0.19 1.32±1.55 1 280 μ g/mL 3 82.60±1.061) 8.51±0.441) 8.89±1.08 0.83±0.69 2 560 μ g/mL 3 72.30±3.08 15.40±1.561) 12.30±2.29 1.33±0.81 5 120 μ g/mL 3 54.96±5.571) 31.20±2.881) 13.84±3.091) 21.48±1.751)与空白组比较,1)P＜0.05

2.3.2 泽兰LLCX对HCASM细胞周期的影响(见表4)

表4 不同浓度泽兰醇洗物(LLCX)对HCASM细胞的影响(±s)%

表4 不同浓度泽兰醇洗物(LLCX)对HCASM细胞的影响(±s)%

药物剂量 n G0/G1 S G2/M apoptosis空白 3 71.88±0.48 19.70±1.81 8.42±1.35 0.57±0.49 40 μ g/mL 3 72.48±0.89 18.05±0.84 9.47±0.92 0.60±0.13 80 μ g/mL 3 78.20±2.101) 13.34±1.591) 8.46±0.54 0.39±0.35 160 μ g/mL 3 85.75±1.481) 7.40±2.581) 6.86±1.11 0.47±0.29 320 μ g/mL 3 78.26±2.161) 12.78±1.921) 8.96±0.62 0.48±0.31 640 μ g/mL 3 55.48±4.081) 28.63±1.711) 14.89±3.881) 32.48±4.901)与空白组比较,1)P＜0.05

3 讨 论

动脉损伤后VSMC的异常增殖是动脉粥样硬化等血管增殖性疾病发生的重要因素[5]。其表型转化是VSMC增殖和迁移的关键性起始步骤,主要表现为从收缩型转变为合成型,获得增殖、迁移和合成、分泌大量细胞外基质的能力。细胞外基质的变化可直接或间接影响VSMC的增殖、黏附及迁移过程[6]。本实验所用细胞采自正常HCASMC,其培养基有两种:一种是维持其处于收缩态的培养基;另一种是促进其由收缩型向合成型转变的培养基。本实验选用第二种培养基,该培养基中添加了重组人碱性成纤维生长因子(hbFGF)和重组人表皮生长因子(hEGF)生长因子,这些因子是使HCASMC由收缩型向合成型转变,其中 bFGF对VSMC有强烈的有丝分裂作用,可促进VSMC增殖和迁移作用[7]。因此,本实验中的HCASMC在生长因子的作用下处于增殖状态。

本实验M TT结果显示泽兰LLST的32 0μ g/mL、6 40 μ g/mL、1 280μ g/mL 浓度组和 LLCX 的 40 μ g/mL、80μ g/mL 、160 μ g/mL浓度组在作用 24 h以后,均能抑制细胞的增殖,该系列浓度均为安全浓度,但是未呈现一定的量效关系。本研究细胞周期结果显示,随着浓度的增加,停留于G0/G1期细胞比例逐渐增加,而处于S期的细胞比例逐渐减少,表明其抑制增殖作用逐渐增强,但对G2/M期的调控作用均不明显。

流式细胞结果显示:泽兰LLST和LLCX抑制增殖作用的最佳药物浓度分别为 1 280 μ g/mL 和 160 μ g/mL,此时,两者镜下观察可见细胞数目变少,部分细胞由星形的丝状细胞变为方形或三角形的细胞,提示平滑肌细胞由合成型逐渐转变成为收缩型,两者折合生药的量分别为8166.4μ g/mL和9 644.8μ g/mL,说明泽兰具有抑制HCASMC增殖的活性。

本实验观察到泽兰两种干粉的两个接近半数致死量的浓度组的MT T结果与流式细胞术结果有较好的对应性。其中最高浓度组(泽兰水提液5 120 μ g/mL浓度组和95%乙醇洗脱液640 μ g/mL浓度组)凋亡明显,镜下观察细胞大量死亡,存活细胞变形缩小,提示此药物浓度已具有较强的毒性作用。泽兰水提液2 560 μ g/mL浓度组及95%乙醇洗脱液 320 μ g/mL浓度组,虽然未见凋亡,但是与最高浓度具有的相似周期转化趋势,镜下观察,细胞部分死亡或变形,细胞数目变少,提示此时已有一定的毒性作用。

现代药理学研究表明:泽兰具有降血脂[8]、抗血小板聚集和抗血栓形成[9]等药理作用。新近的研究显示:泽兰能抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的炎症反应[10],这些环节都与动脉粥样硬化发生发展密切相关。以往的研究显示,泽兰具有抑制多种细胞增殖的作用。本实验初步得出泽兰具有在体外抑制人碱性成纤维生长因子、人表皮生长因子刺激人冠状动脉平滑肌细胞增殖的活性,为泽兰深入研究抗AS活性和机制以及开发创新药物提供基础实验依据。但泽兰抑制细胞增殖的具体作用机制尚不明确,有待于进一步研究。

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