无脊椎动物促性腺激素释放激素研究进展

于新秀，迟长凤，吴常文

(浙江海洋学院，浙江省海洋养殖装备与工程技术重点实验室，浙江舟山 316000)

20世纪70年代初SCHALLY和GUILLEMIN等分别用猪和牛下丘脑分离出1种十肽，分析出肽链组成为pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，并证明它能使垂体释放促黄体生成素故称其为促黄体生成素释放激素(luteining hormone releasing hormone,LHRH)[1]。后来的实验发现LHRH也能促使腺垂体释放促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)，故又称之为促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)。它是下丘脑-垂体-性腺（hypothalamic-pituitary-gonad，HPG）轴的关键信息分子，在性腺发育、性成熟和繁殖功能的维持中起至关重要的调节作用。

GnRH不仅存在于脊椎动物中，也存在于无脊椎动物中。这说明GnRH是一种古老的生殖激素，在脊椎动物出现以前就已经存在；且其生殖调控的功能即使在无垂体的无脊椎动物中，经历了5亿3千万年的进化中几乎没有改变[2]。

GnRH调节促性腺激素的合成与释放，从而调控生殖发育，研究其对生殖腺的表达调控机制，诱导排卵以及调节生殖腺的发育程度具有重要意义。另外，探索可作为神经激素、神经递质、神经调质的GnRH，还有助于改进的GnRH特异激动剂和拮抗剂的分子设计，生产出更多的GnRH类似物，用于养殖动物的人工繁殖。用已经鉴定的GnRH抗体对动物的神经系统(脑和神经管)和性腺进行免疫组织化学定位观察，可以为了解GnRH的存在物种，为GnRH在动物生殖内分泌调控中的作用机制提供形态学依据。用分子克隆的方法在分子水平上研究GnRH，获得其核苷酸序列，为GnRH的进化地位提供了更为确凿的证据。总之，深入研究GnRH，无论是对脊椎动物还是无脊椎动物都具有十分重要的意义。

1 无脊椎动物中的GnRH及其类似物

首先在高等的脊索动物中发现GnRH的存在，随后用免疫组织化学的方法渐渐在无脊椎动物中检测到该肽或其类似物。这改变了曾经一度认为GnRH仅存在于脊索动物的观点，掀起了在无脊椎动物中研究GnRH的热潮。

在过去的十几年中，越来越多的研究者在无脊椎动物中发现GnRH及其类似物，为无脊椎动物中GnRH的普遍存在奠定了基础，也进一步证明GnRH是一种古老的肽，在由低等的无脊椎动物向高等脊椎动物进化的过程中，GnRH对动物的生殖调控活动都起着重要作用。

GnRH的研究已取得重大进展，目前已至少发现28种类型的GnRH，其中15种来自脊椎动物，13种来自无脊椎动物[3]，每个GnRH类型都是以最先鉴别出的动物命名的。在无脊椎动物鉴别出的13种GnRH种类型中，有10种出现在尾索动物的2种海鞘中，还有另外3种出现于软体动物的真蛸Octopus vulgaris、商乌贼Sepia officinalis和海兔Aplysia californica中。

另外，研究者还通过免疫反应等方法在头索动物、半索动物、棘皮动物、节肢动物、扁形动物、线虫动物、刺胞动物等中发现GnRH或其类似物的存在，甚至有学者发现酵母的ɑ-接合因子不仅在结构上与mGnRH同源，而且具有mGnRH的活性，能够刺激哺乳动物垂体LH和FSH的分泌[4]。从而可以推测出GnRH在漫长的动物进化中结构和功能都具有相当的保守性。所有这些研究为无脊椎动物中GnRH的研究奠定了坚实的基础。在这些研究中，除去尾索动物亚门中的被囊动物外，软体动物的GnRH研究相对来说更为深入，已经鉴定出2种GnRH，均为十二肽的氨基酸序列，本文也重点阐述软体动物中的GnRH的结构和功能研究。

1.1 软体动物Mollusca

1.1.1 头足类Cephalopoda

DI COSMO等[5]1998年在真蛸视腺中发现GnRH活性。2002年IWAKOSHI等[6]从Octopus vulgaris的脑中分离出1个十二肽，结构类似于脊椎动物的GnRH，具有其保守的N-末端和C-末端，并将其命名为oct-GnRH。分布在中枢神经的食管上神经节和食管下神经节、小脑复合物以及视腺中，另外在鳃心、输卵管、缠卵腺等处也发现了其免疫活性。oct-GnRH在日本鹌鹑Coturnix coturnix中表现出促黄体生成素释放激素的活性，证明oct-GnRH具有脊椎动物的GnRH活性。这是第一次在软体动物中鉴定出GnRH的结构。IWAKOSHI-UKENA等[7]还发现GnRH具有除生殖调控之外的其他功能，可能作为一个调控因子调节脑的更高级活动，例如摄食、运动、记忆等，oct-GnRH可以调节食管的运动，影响口球的摄食活动，可以调节输卵管和心的伸缩，还可以作为神经调质，影响视觉和触觉。2006年，KANDA等[7]还发现oct-GnRH的受体包含脊椎动物GnRH受体的典型结构域。所有的这些足以证明oct-GnRH属于GnRH家族。

RASTOGI等在枪乌贼Loligo vulgaris的中枢神经和视腺中发现mGnRH的免疫活性。2009年DI CRISTO，DE LISA，DI COSMO研究发现商乌贼Sepia officinalis的GnRH前体cDNA与oct-GnRH的阅读编码框ORF完全相同[9]。这些研究都为其他头足类如曼氏无针乌贼Sepiella maindroni等GnRH的研究提供了宝贵的参考价值。

1.1.2 多板纲Polyplacophora

2003年，GORBMAN等[10]在海水中加入不同浓度的不同种类的GnRH，观察对石鳖Mopalia sp配子释放的影响。结果七鳃鳗lGnRH-Ⅲ、被囊动物tGnRH-Ⅰ以及cGnRH-Ⅱ对其配子的释放没有影响，而lGnRH-Ⅰ和tGnRH-Ⅱ在浓度为1.0 mg/L时，能够刺激成熟配子的释放，在较低的浓度50 μg/L时则没有影响[9]。这说明石鳖的GnRH类似物与lGnRH-Ⅰ和tGnRH-Ⅱ相似，而且其特定受体，可以与这两种GnRH很好地结合。

1.1.3 腹足类Gastropod

1993年GOLDBERG等[11]第一次在软体动物中检测到GnRH的存在，他们使用mGnRH和cGnRH-Ⅱ两种抗体，主要在田螺Helisoma trivolvis的脑和足神经节检测到mGnRH的免疫活性，而在体壁和内脏神经节检测到cGnRH-Ⅱ活性，并且将Helisoma trivolvis的中枢神经的提取物作用于金鱼，会刺激金鱼的垂体释放促性腺激素。1999年，YOUNG等[12]又发现腹足类中的静水椎实螺Lymnaea stagnalis存在GnRH免疫活性。还有学者根据猫头鹰帽贝Lottia gigantea的GnRH前体cDNA推测GnRH序列长度为15个氨基酸[13]。

2009年，NUURAI等[3]在成熟雌性耳鲍Haliotis asinina L的神经节和卵巢中用免疫组织化学的方法检测到七鳃鳗lGnRH-Ⅲ和被囊动物tGnRH-Ⅰ。lGnRH-Ⅲ大量分布于脑神经节和侧足神经节的神经分泌细胞NS1（大小约为10 μm×10 μm）以及脑神经节的小型神经分泌细胞NS2中，还存在于卵巢中的卵原细胞和Ⅰ期卵母细胞中。tGnRH-Ⅰ同样存在于脑神经节和侧足神经节背部的神经分泌细胞NS1,以及腹部的长神经纤维中，在卵巢的Ⅰ期卵母细胞和部分Ⅱ期卵母细胞中也有发现。由此得出的结论是神经组织中的GnRH起着信号传递的作用，且推测卵巢中的GnRH可能形成于卵巢，起着自分泌或旁分泌的作用，直接诱导卵细胞的发育。

ZHANG等[14]从海兔Aplysia californica的中枢神经系统中获得GnRH类似物ap-GnRH的cDNA全长，阅读编码框（ORF）可以编码147个氨基酸，其中ap-GnRH具有12个氨基酸。Aplysia californica是腹足类中第一个确定到GnRH的分子结构的物种。比较ap-GnRH与oct-GnRH的前体发现：具有共同的分子结构，都具有信号肽、十二肽的GnRH以及GnRH相关蛋白（GAP），这与脊椎动物的GnRH前体一致。GAP区的相似度为37.2%，而GnRH的相似度为83.3%，这种选择性的保守使不同物种中的GnRH的功能基本不变[14，15]。

陈蕾、邓陈茂、梁飞龙等[16-18]利用免疫组织化学SABC法和SP法发现合浦珠母贝生殖腺及消化道既能分泌GnRH又能表达其受体，说明GnRH可能通过自分泌或旁分泌作用来调节合浦珠母贝的繁殖及消化功能，这些发现为以后GnRH在合浦珠母贝人工育苗方面的应用奠定了基础。

1.1.4 双壳纲Bivalvia

FRANCK等[19]在太平洋牡蛎Crassostrea gigas的生殖腺中检测到GnRH的受体，并进行了克隆与表达分析，其氨基酸序列与脊椎动物生物受体高度相似。由此推测其体内也可能存在GnRH的类似物。紫贻贝Mytilus edulis和扇贝中也发现GnRH的存在。

1.2 其他无脊椎动物中的GnRH[20]

1.2.1 头索动物Cephalochordata

SCHRIEBMAN等1986年在文昌鱼Branchiostoma belcheri发现GnRH活性[21-24]。GnRH免疫活性细胞分布在文昌鱼的端脑前端和靠近中脑的背部，中脑中部及哈氏窝中。

1.2.2 尾索动物Urochordata

已在被囊动物中发现10种GnRH的不同形式，且结构均已获得鉴定。除去GnRH-Ⅹ为十六肽外，其余均为十肽。免疫组化法发现它分布于脑和中枢神经系统及其周围。

1.2.3 半索动物门Hemichordate

已经在Saccoglossus bromophenolosus和Ptychodera bahamensis中发现GnRH的活性，tunicate GnRH-2会刺激Saccoglossus bromophenolosus的配子快速释放[25]。

1.2.4 棘皮动物Echinoderms

RASTIGI等[26]检测到海胆Paracentrotus lividus存在mGnRH和cGnRH-Ⅰ的免疫活性。

1.2.5 节肢动物Arthropods

1982年，HANSEN等[27]检测到蟑螂Leucophaea maderae中存在GnRH的免疫活性。

2004年，MORGAN等[28]在罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii中用免疫组织化学的方法发现lGnRH-Ⅲ和oct-GnRH，lGnRH-Ⅲ主要分布于中脑的中型神经元，而oct-GnRH则分布于胸部神经节的大型神经元和中型神经元以及其神经纤维中。另外在卵母细胞的细胞质中还观察到lGnRH-Ⅰ。因此，在罗氏沼虾的体内至少存在3种GnRH形式：lGnRH-Ⅲ、oct-GnRH和lGnRH-Ⅰ，lGnRH-Ⅲ和oct-GnRH分布于脑，lGnRH-Ⅰ则存在于卵巢。这与脊椎动物一致，存在2种或2种以上的GnRH类型。

2008年，NGERNSOUNGNERN等[29]斑节对虾Penaeus monodon中使用免疫细胞化学、免疫荧光、高效液相色谱法等方法也检测到oct-GnRH和lGnRH-Ⅲ，它们分布于前脑和食道上神经节的中型神经元。在其中枢神经中并未检测到lGnRH-Ⅰ、sGnRH和mGnRH。这说明斑节对虾中的GnRH与oct-GnRH和lGnRH-Ⅲ更为相似。

2007年，李兆英[30]在中华蜜蜂Apis cerana cerana的卵子、精子以及雄蜂的蛹检测到有GnRH受体的mRNA表达。

由上面的研究可以初步推测节肢动物中存在oct-GnRH和lGnRH-Ⅲ的类似物。

1.2.6 环节动物Annelida

研究者已在水蛭的神经组织以及蚯蚓的非神经组织中发现GnRH的免疫活性，另有学者据多毛纲Capitella sp.GnRH前体cDNA推测GnRH序列长度为15个氨基酸[13]。

1.2.7 线虫动物Nematoda

BROWNLEE等1993年线虫Ascaris suum在中央神经区域发现了GnRH类似物的免疫活性[9]。

1.2.8 扁形动物Platyhelminthes

ANCTIL等[31]在涡虫Bdelloura candida神经束、上皮粘液细胞、卵黄腺以及神经分泌细胞中检测到GnRH的免疫活性[28]。

1.2.9 刺胞动物Cnidaria

ANCTIL[32]在海肾Renilla koellikeri和海葵Nematostella vectensis中发现cGnRH-Ⅱ和mGnRH的存在，广泛分布于内胚层及产生配子的细丝上。

2006年，TWAN等[33]检测到石珊瑚Euphyllia ancora中GnRH的活性。

甚至还有学者在真菌酵母中发现α-接合因子，氨基酸序列为WHWLQLKPGQPMY的十三肽[34]，具有mGnRH的活性，能够刺激哺乳动物垂体LH（Luteining hormone）和FSH(Follicle stimulating hormone)的分泌[35]。

由此可见GnRH几乎在动物界中是普遍存在的。这说明GnRH不仅存在于原口动物和后口动物中，还存在于假体腔的线虫动物、无体腔的扁形动物、仅有两胚层的刺胞动物，甚至可能存在于属于真菌的酵母中。GnRH作为一种古老的肽，且保守性较高，为其他尚未发现GnRH的物种留下了广阔的研究空间。

2 GnRH的种类、结构与功能

2.1 GnRH的种类

在目前已经研究的GnRH中，根据其分布可分为[24]：

GnRH-Ⅰ：分布在下丘脑或间脑，刺激脑垂体释放促性腺激素GtH，主要为mGnRH、cGnRH-Ⅰ、鲷sbGnRH等。

GnRH-Ⅱ：分布在中脑或其他脑区，起着神经递质或调质的作用，间接参与生殖活动的调节，主要为cGnRH-Ⅱ。

GnRH-Ⅲ：分布于嗅叶和端脑，也起着神经递质的作用，主要为鲑鱼sGnRH。

GnRH-Ⅳ：既来自于下丘脑，又分布于中脑和心，主要为七鳃鳗lGnRH。

GnRH-Ⅴ：目前仅有2种且为十二肽：oct-GnRH和ap-GnRH，均来自于无脊椎动物中的软体动物[16]。

这5种GnRH的系统进化关系如图1所示。

2.2 无脊椎动物中GnRH的结构与功能

2.2.1 无脊椎动物中GnRH结构

在脊椎动物中，已鉴别的GnRH都是由10个氨基酸构成，包括起始的第一位的焦谷氨酸（pGlu）、第四位的丝氨酸（Ser）、第九位的脯氨酸（Pro）和第十位的甘氨酸（Gly），这4个氨基酸序列很保守。GnRH的长度及部分氨基酸序列的高度保守，表明这些保守的分子结构对其生物活性、与受体的结合以及对酶解得抵抗力方面都起着重要的作用。

而在无脊椎动物中（背囊动物GnRH为脊索动物中的无脊椎动物[20]，GnRH与脊椎动物基本一致，故排除）仅有软体动物中的真蛸oct-GnRH、Sepia officinalis GnRH和海兔ap-GnRH的cDNA序列已经克隆，氨基酸序列得到鉴定，其前体的基本结构均包括信号肽、GnRH、断裂位点和GnRH相关肽GAP。其中GnRH均为12个氨基酸的肽，它们的1、4、6、8、12位氨基酸与mGnRH的1、2、4、6、10位的氨基酸相同，有共同的C-末端和N-末端，可认为在mGnRH的第一和第二位氨基酸间插入2个氨基酸——天冬酰胺Asn和酪氨酸Tyr。真蛸oct-GnRH和Sepia officinalis GnRH氨基酸序列完全相同，而oct-GnRH与ap-GnRH仅在第10位和第11位的氨基酸有差别，其余的氨基酸序列则完全相同，这为研究其他软体动物的GnRH提供了很好的启发。mGnRH、oct-GnRH、ap-GnRH的氨基酸序列结构见表1。

图1 脊索动物门与软体动物门GnRH的系统进化分析图[16]Fig.1 Phylogenetic analysis of GnRH in phylum chordata and phylum Mollusca分支上的数字为重复1 000次的自展值.

表1 oct-GnRH、ap-GnRH和mGnRH的氨基酸序列比对Tab.1 Amino acid sequences aligned among oct-GnRH，ap-GnRH and mGnRH

2.2.2 无脊椎动物中GnRH功能

在脊椎动物中，促性腺激素释放激素(GnRH)是由的脑(主要是视前—下丘脑)产生的一类十肽激素,它对脑垂体促性腺激素(GtH)的合成分泌的神经调节中起关键作用[36]。GnRH通过调节血浆GtH及性类固醇的水平,能够改变动物的性行为，是生殖生物学研究的核心内容之一。

研究表明，GnRH及其类似物在无脊椎动物中也起着刺激生殖活动的作用。如用哺乳动物的mGnRH和cGnRH-Ⅰ与被囊动物（Ciona intestinalis）的性腺进行离体孵育培养，能够促进性腺的固醇类激素的释放；向被囊动物注射各种类型的GnRH，能够诱导其配子的释放。

GOLDBERG等[11]研究了田螺Helisoma trivolvis的mGnRH和cGnRH-Ⅱ的活性，且将Helisoma trivolvis的中枢神经的提取物作用于金鱼，会刺激金鱼的垂体释放促性腺激素，并且mGnRH还能促进田螺产卵量的增加。

研究还表明：GnRH在一些无脊椎动物中还起着性外激素的作用，促进需要在水中受精的生物受精。如在海水中加入低浓度的特定GnRH，能够诱导半索动物（Sacoglossus sp.）和软体动物（Mopalia sp.）的成熟个体产卵，将成熟的配子迅速释放到海水中[37]。

oct-GnRH具有除生殖调控之外的其他功能，可能作为一个神经调质调节Octopus vulgaris脑的更高级活动，例如摄食、运动、记忆等，oct-GnRH可以调节食管的运动，影响口球的摄食活动，可以调节输卵管、血管和鳃心的伸缩以及心跳的时间和力度，还可以作为神经调质，影响视觉和触觉类似于小脑的区域[13]。

可见，GnRH在由低等无脊椎动物向高等脊椎动物进化的过程中，对动物的生殖活动的调控都起着重要的作用。

3 总结

综上所述，GnRH在动物界中具有普遍存在性，且主要分布于动物的中枢神经以及性腺、心等非神经组织中，这为无脊椎动物的GnRH生殖调控的研究提供了参考。目前，除被囊动物外，仅有Octopus vulgaris、Sepia officinalis和Aplysia californica鉴定了GnRH的结构，因此在尚未研究的无脊椎动物中还具有广阔的研究空间。当然随着GnRH在无脊椎动物中的深入研究，一些新的问题也会随之出现。

脊索动物中已确定的GnRH均由10个氨基酸构成，在其进化的过程中，不仅肽链的长度保持不变，而且部分氨基酸序列与也保持不变，包括起始的第一位pGlu、第四位的Ser、第九位的Pro和第十位的Gly。通过表1中无脊椎动物中的oct-GnRH、ap-GnRH和mGnRH的比对，发现oct-GnRH和ap-GnRH与脊索动物一样也具有这些保守的氨基酸序列。这表明GnRH保守的分子结构对其生物活性、与受体的结合以及对酶解得抵抗力方面都起着重要的作用，这种选择性的保守使不同物种中的GnRH的功能基本不变。

虽然无脊椎动物与脊索动物的GnRH存在一定的保守性，但也出现了一定的差异性。如从无脊椎动物中已鉴定出的oct-GnRH和ap-GnRH结构来看，与脊索动物的GnRH的肽链的长度不同，且均大于10个氨基酸序列，这可能是GnRH的基因在漫长的进化过程中出现了核苷酸序列的部分丢失所致。

还有一个问题就是如何定义GnRH？目前还没有一个非常明确的定义。酵母中的α-接合因子虽被认为是GnRH的类似物，具有mGnRH的活性，刺激哺乳动物垂体中LH和FSH的分泌，但是其氨基酸序列为WHWLQLKPGQPMY[34]，与常规的GnRH结构没有任何的相似性。即α-接合因子与GnRH的功能类似，结构存在明显的差异，这也可能是α-接合因子与哺乳动物的GnRH具有相同的受体，使其具有GnRH的作用。

所有的这些问题都需要对GnRH作深入细致的研究后才有可能得以解决。

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