组分配伍对人参总皂苷中主要成分体外吸收的影响

林力 祖凤英 张巍巍 谭鹏 王刚 李光赜 蒙莉

复方双参通冠由人参、丹参和元胡三药有效部位组成，临床主要用于治疗气血郁滞、心失所养所致的冠心病心绞痛。方中君药人参自古作为“开心益智、轻身延年”的上品，其主要成分采用人参总皂苷，人参皂苷是人参所含的最为重要的一类生理活性物质，约占人参组成的3%。现代药理研究表明人参皂苷具有改善微循环、提高组织抗缺氧能力、抑制血小板聚集、抗肿瘤、抗衰老等多种生物活性，近年来人们发现其在心血管系统中也具有较好的作用，可以保护心功能、阻滞钙通道、抗自由基、抗休克、抗脑缺血、保护脑损伤等［1］。本室前期整体药理学和细胞药理学研究都显示复方配伍给药的药效要优于人参给药的药效。本文尝试从药代动力学角度，探讨复方配伍对皂苷中Rg1、Re、Rb1和Rd四种成分肠吸收的影响，以期阐释复方配伍应用的合理性。

1 材料和仪器

1.1 药品和试剂 Ginsenoside Rg1，Re和Rb1对照品，均购自中药药品生物制品检定所;Ginsenoside Rd对照品，南京青泽医药，纯度大于98%。人参总皂苷、丹参总酚酸和延胡索总生物碱均由中国中医科学院西苑医院药学室m提供，批号依次为040801、050816和060927。

牛血清白蛋白Ⅴ购自北京世纪银丰，考马斯亮蓝G-250购自华美生物工程有限公司;Tissue Culture 199培养基(Invitrogen Corporation)，北京夏斯生物科技有限公司;甲酸和甲醇均为色谱纯，分别购自美国Fisher公司和J.T.BAKER公司;水为娃哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司生产;其他试剂均为市售分析纯。

1.2 实验动物 Wistar大鼠，雄性，体重为(220±20)g，中国医学科学院动物实验研究中心提供，许可证号SCXY(京)2004-0001。

1.3 实验仪器 API 4000 Q-TRAP型三重四极杆串联质谱仪，配有离子喷雾离子源以及Analysis 1.4数据处理系统，美国Applied Biosystem公司;Agilent 1200高效液相色谱输液泵，自动进样器，Agilent 8453紫外可见分光光度仪，色谱柱为 Agilent ZORBAX SB-C18 柱(150 × 4.6 mm I.D.，5 μm)，均为美国Agilent公司。Micro 22R台式高速冷冻离心机，德国Hettich公司;AG-245分析天平和320 pH计，美国Mettler Toledo公司。

2 实验方法

2.1 样品溶液配制 实验分为人参总皂苷组和复方组，取各组样品适量，用TC199培养液分别配制成浓度为0.0625、0.125、0.25 mg/ml和 0.281、0.563、1.125 mg/ml的溶液(两组中含有人参提取物的量相同)，待用。

2.2 肠囊的制备和孵育 实验采用改良的大鼠肠囊外翻法［2］进行研究。取禁食后大鼠，脱颈椎处死，从胃幽门以下15 cm开始向下取出整段小肠，用生理盐水灌洗后转移至TC199培养液中，剥离肠表面的脂肪及血管，将其分成4.5 cm左右的肠囊，外翻后内侧注入0.8 ml的TC199溶液，外侧加入含有待测药品的TC199培养基溶液，于37℃振荡水浴(60 cycle/min)中孵育，在 120 min 取样 200 μl，4℃高速离心后待测。同时取出肠囊，应用考马斯亮蓝法［3］进行蛋白含量的测定。每个时间点实验重复3次。

2.3 肠囊吸收成分定量分析方法 色谱条件:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(150 ×4.6 mm I.D.，5 m)，流动相为甲醇-0.1%的甲酸溶液，梯度洗脱(0-4 min-58%MeOH，6 min-90%MeOH，6.01 min-58%MeOH)。流速为 0.5 ml/min，柱温为 20℃。

质谱条件:离子喷射电压5500 V，源内气体GS1为448.18 Kpa，源内气体GS2为310.28 Kpa，气帘气体137.9 Kpa，碰撞气High，源内温度500℃。检测方式为正离子检测，扫描方式为选择反应监测(MRM)方式，用于定量分析的离子对(m/z):823.6/203.1(人参皂苷 Rg1)，969.7/789.0(人参皂苷Re)，1131.8/365.1(人参皂苷Rb1)和823.6/789.5(人参皂苷Rd)。

2.4 数据分析 小肠对药物的吸收可能由于有效吸收面积的不同而不同，因此不能以直接测定的药物浓度来计算药物的肠吸收。考虑到精确测定肠囊表面积较为困难，同时由于肠表面积与肠蛋白含量具有一定的线性关系［2］，因此本文采用肠蛋白量进行校正，以消除不同批次肠囊大小对吸收结果的差异。对于不同配伍引起化合物的吸收差异，用单位肠蛋白累积吸收总量表示。实验采用EXCEL进行数据分析处理，实验结果用“±s”表示，不同给药方式下肠转运药物差别用t检验。

3 实验结果

3.1 LC-MS-MS方法学确证

3.1.1 标准曲线及线性范围 取TC199培养液160 L，依次加入人参皂苷系列对照品溶液40 L，按2.2样品处理项下操作，建立工作曲线。用加权最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程。Rg1的标准曲线为 Y =71563.172+10871.216 X，相关系数0.990，权重为W=1/CC，线性范围10～5000 ng/ml;Re的标准曲线为 Y =37118.760 +6273.083 X，相关系数0.993，权重为W=1/CC，线性范围10～5000 ng/mL;Rb1的标准曲线为 Y =-48550.506+11633.850 X，相关系数0.995，权重为W=1/CC，线性范围10～5000 ng/mL;Rd的标准曲线为 Y =2540.112+1173.579 X，相关系数0.999，权重为W=1/CC，线性范围4～2000 ng/mL。

3.1.2 回收率、精密度、准确度和稳定性实验 在标准曲线范围内选择高、中和低三种浓度(人参皂苷Rg1、Re和Rb1的三个浓度分别为25、100和5000 ng/ml，人参皂苷Rd分别为8、80和2000 ng/ml)，以空白 TC199配制人参皂苷 Rg1、Re、Rb1和Rd三个浓度的QC样品，每个浓度点5份样品，将相同浓度的样品按照样品处理方法与处理后分析，分别计算其回收率精密度和准确度实验。三种浓度下Rg1、Re、Rb1和Rd的回收率为70% ～100%，精密度的RSD在0.33% ～14.44%之间，准确度在81%～101%之间。人参皂苷在室温24h空白TC199中样品稳定性符合测定要求。

3.1.3 小结 本方法生物样品中人参皂苷类成分的测定方法表明:TC199培养液中内源性杂质不干扰样品的测定，药物平均回收率均在70%以上，变异系数小于15%;最低定量限Rg1、Re和Rb1均为10 ng/mL，Rd为4 ng/ml，相关系数均超过了0.99，日内精密度和稳定性符合相关要求。

3.2 组分配伍对肠吸收成分影响结果 不同剂量组下组分配伍给药和单一组分给药在各时间点测定结果如表1所示，实验结果表明对于人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd在低剂量组组分配伍给药均促进其吸收，中剂量和高剂量组分配伍给药与单一组分给药没有统计学差异，但有随着剂量的增加组分配伍给药有抑制成分吸收的趋势。

表1 四种人参皂苷吸收情况(ng/mg protein)

4 讨论

人参皂苷是人参中十分重要的一类主要成分，具有非常广泛的药理作用，但过低的口服生物利用度严重限制了其应用和发展的前景，目前很多学者尝试从体外肠吸收实验探讨原因，如李昊等［4］应用LC-MS方法从肠道吸收这个环节对其Rg1生物利用度低的原因进行了初步的探索，结果表明Rg1比较容易透过肠壁屏障，其吸收呈明显的时间依赖性。同时考察了P-糖蛋白对Rg1的影响，结果表明加入P-糖蛋白抑制剂组与不加组统计学分析表明无显著性差异，表明P-糖蛋白对药物的外排作用可能也不是造成其生物利用度低的原因。彭缨［5］采用在体小肠回流试验装置对Re的大鼠小肠吸收动力学进行了研究。实验结果表明，Re在大鼠小肠内吸收率为9.6%。本实验也应用肠外翻方法，但研究目的是探讨不同给药方式对人参主要成分吸收的规律研究。

本实验应用LC-MS/MS方法对探讨了复方配伍对人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd四个成分肠吸收的影响，结果显示在低剂量组，复方配伍可以增加四种皂苷类成分的吸收，但在中剂量和高剂量组下，复方配伍给药和单一组分给药对这四种皂苷类成分的吸收影响没有显著差异。表明复方配伍后药效的增加不是与配伍在吸收环节增加了皂苷类成分的吸收有关，具体原因有待于进一步的研究。

［1］Wang Xiao-mo.Progress of Pharmacological Action of Ginseng.Ginseng Rearch，2001，13(3):2-10.

［2］Barthe L，Bessouet M，Woodley J F，et al.The improved everted gut sac:a simple method to study intestinal P-glycoprotein.Int J Pharm，1998，173:255-258.

［3］Wilson TH，Wiseman G.The use of sacs of everted of substances from the mucusoal to the serosal surface. J Physiol，1954，123:117.

［4］李昊，孙建国，谢海棠，王睿，等.大鼠肠管外翻模型对人参皂苷Rg1吸收机制的研究.中国临床药理学与治疗学，2000，9(5):510-513.

［5］彭缨.人参皂苷Re及其固体分散物药物动力学研究.沈阳药科大学，2001.