NaCl胁迫对芨芨草苗期脯氨酸代谢的影响

董秋丽，夏方山，董宽虎

（山西农业大学动物科技学院，山西 太谷030801）

土壤盐渍化是人类面临的世界性问题，全球约有100多个国家存在不同类型盐碱地，占陆地面积的10%左右［1］，其引起的渗透胁迫已对植物的生长和产量造成了很大的影响。在渗透胁迫下，植物能否保持正常生长状况，关键在于能否维持体内的水分平衡，而这正是通过积累一定量的溶质，降低植物体内的水势实现的［2］。脯氨酸是公认的在细胞中起着无毒渗透保护作用的细胞相溶性物质，它被广泛的积累在各器官中，Pro的积累受多种因素的调控，如：它自身的合成、分解，用于蛋白质的合成及在不同器官中的运输［3］。植物的Pro合成、累积及代谢是一个受非生物胁迫和细胞内Pro浓度调控的生理生化过程［4，5］。已证明植物体内存在2条Pro合成途径，根据起始氨基酸命名为Glu途径和Orn途径，P5CS和δ－OAT分别是这2个途径的关键酶。支立峰等［6］用飞蛾豆（Vignaaconitifolia）中的P5CS基因转化水稻（Oryzaglaberrima），再用250 mmol／L NaCl胁迫处理后，转基因细胞的Pro含量提高，同时转基因细胞的耐盐性比野生型增强。陈吉宝等［7］发现胁迫下普通菜豆幼苗叶和根中脯氨酸合成酶基因PvP5CS2的转录水平快速上升，随着胁迫时间的延长，转录水平逐渐下降；在逆境胁迫下，幼苗叶和根中Pro大量积累，高峰出现在Pv P5CS2基因表达高峰之后。徐春波等［8］将P5CS去除反馈抑制的突变型P5CS－F129A基因转入冰草（Agropyron）导致植物体中Pro含量成倍增加。这些结果均说明，PvP5CS2基因的表达受干旱、高盐和冷胁迫诱导，Pro积累受PvP5CS2基因转录水平的调控。Roosens等［9］发现转δ－OAT基因烟草合成的Pro在无胁迫时比对照高3倍，且组成型超表达δ－OAT基因并没有影响植物在正常条件下的生长；在0.2 mol／L NaCl或等渗的甘露醇胁迫下，转基因株系积累的Pro比对照高1.5倍，而且有更高的生物量和萌发率。有研究表明，不同植物、不同组织、不同生理条件下2条途径对Pro积累的贡献大小存在差异［10］。Pro合成过程中究竟是哪一条途径居于主导地位，还有待进一步研究。

芨芨草（Achnatherumsplendens）属禾本科芨芨草属旱中生多年草本植物，也是一种泌盐植物，具有很强的抗盐碱性［11，12］。目前，对于芨芨草耐盐性的研究很少［12，13］，多见于种植芨芨草生态经济效益方面的研究。而通过生物措施进行盐碱地改良是经济长久的方法，牧草在盐碱地改良利用中具有重要作用和利用前景［14］。因此，研究芨芨草盐胁迫下的生理变化及耐盐性机理，对于改良盐碱草地具有重要的实践意义。对其苗期盐胁迫下Pro代谢途径进行研究，明确在盐胁迫下芨芨草的Pro代谢途径及在不同器官中的运输，以期为盐碱地植被恢复与改良提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试草种及来源

试验用芨芨草种子于2008年10月13日采自山西省偏关县天峰坪镇梨园村的农田地埂，海拔1 018 m，111°22′19.1″E，39°27′56.8″N。

1.2 试验方法

本试验在山西农业大学草业科学系日光能温室进行。将种子（100粒／盆）播种于蛭石与珍珠岩体积比为1∶1的塑料盆中（直径25 cm、高20 cm），插入PVC管以便浇水及营养液，置于昼夜温度为25／17℃，相对湿度为65%～80%的温室条件下进行培养。出苗后，每隔2 d用Hoagland营养液浇灌1次，处理于17：00－20：00时进行。其余时间用蒸馏水补充失水，以称重法确定失水量，当苗龄达2～3周时每盆定苗60株。当出苗7周后对其进行盐分胁迫，以0（CK），100，200，300，400和500 mmol／L NaCl 6个浓度的营养液为处理液，隔天按100 mmol／L梯度进行递增，直至达到指定浓度，对照只灌完全营养液，3次重复，采用随机区组设计。每组盐胁迫1周后，分别采集其叶片和根系，置于－80℃冰箱保存，进行相关指标的测定。

1.3 测定方法

1.3.1 Pro含量的测定 按照Bates等［15］的方法。

1.3.2 P5CS的测定 P5CS的抽提方法按照Kavi Kishor等［16］的方法进行。蛋白含量以牛血清蛋白为标准蛋白质，按照Bradford［17］的方法。P5CS活性测定按照 Garcia－Rios等［18］的方法进行。

1.3.3 δ－OAT活性的测定 粗酶提取按照Roosens等［19］的方法进行，蛋白含量以牛血清蛋白为标准蛋白质，参照Bradford［17］的方法。

δ－OAT活性的测定参照Kim等［20］的方法，略做改动。反应体系为：50 mmol／L的磷酸缓冲液、35 mmol／L L－鸟氨酸、5 mmol／Lα－酮戊二酸和0.05 mmol／L磷酸吡哆醛混合，总体积为0.9 m L，再加入0.1 m L酶液，在25℃条件下反应20 min后加入0.3 m L 3 mol／L的高氯酸终止反应，然后加入0.2 m L 2%茚三酮沸水中加热20 min染色，冷却后10 000 r／min离心弃去上清液；用1.5 m L无水乙醇溶解红色沉淀物，离心后取上清液510 nm测定吸光值。产物吡咯啉－5－羧酸（P5C）与茚三酮生成的红色物质摩尔消光系数为16.5 L／（mmol·cm）。以每min生成0.001 mmol P5C的量为1个δ－OAT活性单位（U）。

1.3.4 ProDH的测定 参照Lutts等［21］方法提取，略做改动。样品加4倍体积提取缓冲液（w／v）于冰浴中研磨，提取缓冲液为0.1 mol／L Na2HPO4－KH2PO4（p H 7.8），内含1 mmol／L EDTA，10 mmol／L巯基乙醇。匀浆液经3层纱布过滤后3 898 r／min离心15 min。上清液加Triton X－100至终浓度0.15%，涡悬后于冰浴中放置30 min，后于19 491 r／min离心20 min，上清液测酶活性。

活性测定反应混合液体积为2.5 m L，内含0.15 mol／L Na2CO3－Na HCO3（p H 10.3）缓冲液1.6 m L，0.2 m L 0.1 mol／L L－Pro，0.2 m L 0.9 mmol／L 2，6－二氯酚靛酚。30℃水浴中保温5 min，加入0.5 m L（0.8 mg蛋白／m L）酶提取液，混合均匀后加入0.2 m L吩嗪硫酸甲酯试剂PMS（9 mg／m L，现配），摇匀后立即于600 nm下检测光密度变化。以每min A600减少0.001为1个ProDH酶活单位（U）。

1.4 统计分析

试验数据采用Excel 2003及SAS 8.0统计软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对芨芨草Pro含量的影响

随着NaCl浓度的增加，芨芨草植株根系与叶片中Pro的含量均呈上升趋势（表1），且均显著高于对照（P＜0.05）；在同一浓度胁迫下，芨芨草叶片中Pro的含量均显著高于根系（P＜0.05），为根系的1.93～7.92倍；当NaCl浓度为500 mmol／L时，芨芨草植株根系与叶片中Pro含量均达到最大值，为303.36和585.77μg／g FW（鲜重），分别是对照的74和18倍。随着NaCl浓度的增加，芨芨草根系中Pro含量上升的幅度大于叶片。芨芨草植株根系与叶片中Pro含量的急剧上升，说明芨芨草对NaCl胁迫的适应能力较强。

表1 NaCl胁迫下芨芨草根系与叶片Pro含量的变化Table 1 Changes of proline content in A.splendens under NaCl stress μg／g FW

2.2 NaCl胁迫对P5CS活性的影响

除200 mmol／L NaCl浓度胁迫时，芨芨草根系与叶片P5CS活性差异不显著外（P＞0.05），其他浓度胁迫下，芨芨草根系中的P5CS活性均显著高于叶片（P＜0.05）。在不同浓度NaCl胁迫下，除200 mmol／L浓度胁迫时，芨芨草根系中的P5CS活性与对照差异不显著外（P＞0.05），其余浓度胁迫下，芨芨草根系中P5CS活性均显著高于对照（P＜0.05）；NaCl浓度为300 mmol／L时，芨芨草叶片中P5CS活性显著高于对照外（P＜0.05），其他浓度胁迫下，芨芨草叶片中P5CS活性均显著低于对照（P＜0.05）。当NaCl浓度为300 mmol／L时，芨芨草叶片与根系中P5CS活性均达到最大值，为7.44和20.81 U／mg蛋白，分别为对照的1.1和6.3倍。在NaCl的胁迫下，随着盐浓度的增加，芨芨草叶片P5CS的活性呈“降－升－降”的趋势（图1）。

图1 NaCl胁迫下芨芨草根系与叶片P5CS活性的变化Fig.1 Changes of P5CS in A.splendens under NaCl stress

2.3 NaCl胁迫对δ－OAT活性的影响

在NaCl胁迫下，芨芨草根系中的δ－OAT活性显著高于叶片中的（P＜0.05）；芨芨草叶片与根系中的δ－OAT活性均显著低于对照（P＜0.05），但在不同浓度的NaCl胁迫下，δ－OAT活性的变化幅度不大。随着盐浓度的增加，叶片与根系中的δ－OAT活性均呈先下降后上升的趋势。当NaCl浓度为300和400 mmol／L时，芨芨草根系与叶片中的δ－OAT活性降至最低，较对照分别降低45.87%和72.24%（图2）。这说明NaCl胁迫下，芨芨草中δ－OAT活性受到抑制，所以Pro含量的急剧上升可能不是通过鸟氨酸途径合成的。

2.4 NaCl胁迫对ProDH活性的影响

在NaCl胁迫下，芨芨草叶片中ProDH酶的活性均显著高于根系中的（P＜0.05），且均显著高于对照（P＜0.05）。随着NaCl浓度的增加，芨芨草叶片中ProDH的活性呈先上升后下降的趋势，当NaCl浓度为200 mmol／L时，ProDH活性达到最大值，为66.04 U／g FW，是对照的1.7倍。芨芨草根系中的ProDH活性随着NaCl浓度的增加变化不明显，在浓度为100 mmol／L时，芨芨草根系中ProDH的活性上升到最大值为30.47 U／g FW，且显著高于对照外（P＜0.05），其他浓度胁迫下，均差异不显著（P＞0.05）。当 NaCl浓度为300 mmol／L时，芨芨草根系中ProDH 活性最小，为21.95 U／g FW，是对照的86.30%（图3）。

3 讨论

3.1 NaCl胁迫对芨芨草植株不同器官Pro含量的影响

在盐胁迫下，Pro是公认的渗透保护剂，各组织中游离Pro含量的多少，直接关系到其抗逆性的强弱。Pro能防止水分散失，保护膜结构的完整性，所以细胞内Pro的升高可作为植物抗性的指标［22］。近年来对盐胁迫下植物的生理代谢调节方面的研究表明，在盐胁迫的条件下胞质内产生大量的渗透调节物质，在正常生长条件下，植物体内的游离Pro含量较低，但在盐碱胁迫下，游离Pro的含量明显增加［23］。陈托兄等［24］也指出：抗盐植物中游离Pro多集中于代谢旺盛的光合器官和生殖器官，其Pro的含量是其他部位的数倍到数十倍，在盐逆境下植物优先保护其光合器官和生殖器官，这是植物对盐渍生境的一种生态适应对策。张金林等［25］研究表明：NaCl胁迫下，湖南稷子（Echinochloacrusgalli）地上部的游离Pro是根中的10倍多。吴欣明等［26］研究表明：随NaCl浓度的升高，7份羊茅属（Festuca）植物叶绿素和光合速率呈递减趋势，Pro呈增高趋势。孟林等［27］同样证实了NaCl胁迫下，34份偃麦草属（Elytrigia）植物种质材料叶片的Pro随胁迫浓度的增加而呈递增趋势，这与本试验研究结果一致（表1）。芨芨草叶片中的Pro含量显著高于根系中的，可能是由于在盐逆境下植物为优先保护其光合器官和生殖器官，将根系中合成的Pro运输到叶片。这与全先庆等［28］得出的Pro大多在植物的根中合成，而产物大部分被运输到地上部分的研究结果一致。造成芨芨草植株地上部Pro积累的原因还可能与植株地上部光呼吸乙醇酸途径的激活和Glu脱氢酶的活化相关［15］，还有待进一步的研究。Pro含量的大量增加，提高了缓解渗透胁迫的能力，从而增强了芨芨草植株在NaCl胁迫下的抗逆性。

图2 NaCl胁迫下芨芨草根系与叶片δ－OAT活性的变化Fig.2 Changes ofδ－OAT in A.splendens under NaCl stress

图3 NaCl胁迫下芨芨草根系与叶片ProDH活性的变化Fig.3 Changes of ProDH in A.splendens under NaCl stress

3.2 NaCl胁迫对芨芨草植株脯氨酸代谢途径的影响

根尖部位是感知胁迫最敏感部位，植株受到的胁迫往往最先由根部感知，在此状况下，其生理反应可能与叶片的生理反应不尽相同［4］。在NaCl胁迫下，除根系P5CS的活性显著高于对照外（P＜0.05），芨芨草叶片中P5CS的活性、根系与叶片δ－OAT的活性均显著低于对照（P＜0.05）。由此可见，芨芨草Pro的积累主要在根系中以谷氨酸途径合成。研究表明，在渗透胁迫和低氮条件下谷氨酸途径占主导地位，而在非胁迫条件及高氮条件下鸟氨酸又居于主导地位［29］。黄诚梅等［30］的研究也表明，渗透胁迫下，甘蔗（Saccharumofficinarum）幼苗叶片Pro生物合成以谷氨酸－Pro途径为主。这与本试验结论相一致。当NaCl的浓度高于300 mmol／L时，叶片P5CS的活性开始下降，可能是由于Pro浓度的大量增加，其活性受到Pro含量的反馈抑制［31］。ProDH是植物体内控制Pro降解的关键酶，在渗透胁迫时其表达活性受到抑制［30］。在NaCl胁迫下，芨芨草叶片中的ProDH的活性显著高于根系（P＜0.05），主要是由于ProDH基因被Pro诱导而被渗透胁迫抑制［2］。可见，芨芨草Pro含量的积累是由合成和降解综合作用的结果。

4 结论

NaCl胁迫下，芨芨草植株叶片的Pro含量显著高于根系，芨芨草Pro含量随NaCl胁迫浓度的增加而增加，当NaCl浓度达500 mmol／L时，Pro含量最大。

芨芨草植株根系P5CS活性显著高于对照，在同一浓度胁迫下，根系活性均高于叶片；随着NaCl浓度的增加，δ－OAT活性呈降低趋势，均显著低于对照；叶片ProDH活性高于对照，而根系ProDH活性较对照变化不太明显。

NaCl胁迫下，芨芨草植株内Pro的积累主要以谷氨酸途径为主。

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