γ射线对沟叶结缕草愈伤组织再生和耐盐性的影响

贾玉芳，陈曙，柴明良

（浙江大学园林研究所，浙江 杭州310029）

植物在组织培养过程中，通过愈伤组织再生诱导的体细胞无性系会发生广泛的变异，即体细胞无性系变异［1］，它来源于已存在的细胞变异和培养过程中诱导的变异［2］。体细胞无性系突变体的筛选在草坪草抗逆性育种方面已经取得了一些成果。Chai等［3］在结缕草（Zoysiajaponica）愈伤组织培养过程中，通过在培养基中添加褐斑病菌株（Rhizoctoniasolani，AG 2－2，Ⅳ）培养液，筛选出对褐斑病具有较高抗性的株系。Lu等［4，5］对三倍体狗牙根（Cynodontransvaalensis×C.dactylon）悬浮培养的再生植株进行干旱胁迫，获得了耐旱性较高的突变体；还通过愈伤组织抗NaCl筛选，获得了三倍体狗牙根耐盐性变异株系［6］。在组织培养过程中，施加一定的诱变剂可以进一步增加再生植株的变异频率，获得更多的变异材料。辐射诱变具有较高的变异频率和变异范围，能够在短时间内获得稳定遗传的突变体，已在高羊茅（Festucaarundinaceae）［7］、狗牙根（C.dactylon）［8］、日本结缕草（Z.japonica）［9］等多种草坪草上有所应用。辐射诱变与离体筛选相结合已经成为一种重要的育种手段。

沟叶结缕草（Z.matrella）是一种广泛应用的优良暖季型草坪草。它在自然界中通过匍匐茎无性繁殖，因此不能用杂交育种等传统方法对其进行遗传改良，而通过体细胞无性系变异等生物技术提高其抗逆性是一种有效的途径。随着世界范围内土壤盐渍化问题的加剧，关于草坪草耐盐性的研究越来越受到重视［10，11］。研究表明，在自然界中沟叶结缕草是一种比较耐盐的草坪草［12］，有望通过体细胞无性系变异筛选获得耐盐性较强的突变体。虽然沟叶结缕草已经通过茎尖诱导的丛生芽［13］以及幼花序和茎节［14］诱导出愈伤组织，并获得了再生植株，但是关于其辐射诱变和耐盐性离体筛选的研究，至今还未见报道。

本实验室经过多年的离体试验，已经熟练掌握了以沟叶结缕草匍匐茎段为外植体诱导愈伤组织的技术，并且建立了高效的再生体系。本试验以沟叶结缕草胚性愈伤组织为试材，比较了0（对照）和10 Gy的60Coγ射线辐照对愈伤组织再生能力以及再生植株过氧化酶活性和脯氨酸含量的影响，并通过辐射后愈伤组织的抗NaCl筛选，获得了在含1.0%NaCl的再生培养基上保持旺盛生长的试管苗，旨在为沟叶结缕草的辐射诱导耐盐性育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

沟叶结缕草匍匐茎诱导的胚性愈伤组织。

1.2 愈伤组织辐射处理

以 MS＋2.0 mg／L 2，4－D＋1.15 g／L脯氨酸＋40 g／L蔗糖＋5.3 g／L琼脂粉的培养基上继代培养的愈伤组织为材料，取生长旺盛、均匀一致的胚性愈伤组织20皿，于2007年3月在浙江大学核农所辐照中心进行60Co急性照射。辐射剂量分0（对照）和10 Gy 2个梯度水平，每种辐射剂量各处理10皿。辐射后的愈伤组织在（25±2）℃条件下暗培养。

1.3 愈伤组织再生能力的测定

辐射后，取一部分愈伤组织进行再生能力的测定。再生培养基为1／2MS（大量元素减半）＋0.1 mg／L BA＋30 g／L蔗糖＋5.3 g／L琼脂粉。以直径约3 mm的愈伤组织小块为外植体，每皿接种16小块，每辐射剂量设5皿重复，于光强约12.5μmol／（m2·s），每天光照12 h，（25±2）℃条件下培养。愈伤组织再生过程中颜色由黄转绿，膨大生长，表面产生绿色瘤状突起，并分化形成绿色的小苗。4周后观察其再生情况。测量每块外植体的直径，大多数外植体直径在5 mm以上，因此以5 mm作为衡量其再生速度的一个标准，直径超过5 mm的外植体比率越高，则表明其生长速度越快。同时统计分化形成3个以上小苗的外植体比率和愈伤组织再生率（再生的愈伤组织块数／总愈伤组织块数）。用上述3个指标综合衡量愈伤组织的再生能力。

1.4 再生植株CAT、SOD、POD活性和脯氨酸含量测定

将上述再生植株移栽到温室，8周后长成生长旺盛的成熟植株。取不同辐射处理的再生植株幼嫩叶片0.2 g，加3 m L 50 mmol／L的磷酸缓冲液（p H 7.8，含0.2 mmol／L乙二胺四乙酸，1%聚乙烯吡咯烷酮），于冰浴中研磨提取，匀浆液于4℃下12 000 r／min离心20 min，取上清液用于过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性测定。每个处理设3次重复。CAT活性测定参照Lu等［6］的方法；SOD活性测定采用NBT（氮蓝四唑）光还原法［15］；POD活性测定采用愈创木酚法［16］；脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮比色法［15］。采用UV－2550型分光光度计（日本SHIMADZU公司生产）测定吸光度，计算各指标的含量。

1.5 愈伤组织抗盐筛选

辐射处理的愈伤组织经过4周继代培养后进行抗盐筛选。取直径约3 mm的愈伤组织小块，接种到分别添加了0%，0.5%，1.0%，1.5%和2.0%NaCl的再生培养基上，每皿接种16小块，每个处理设5皿重复，于光强约12.5μmol／（m2·s），每天光照12 h，（25±2）℃条件下培养。8周后观察其再生情况。由于在含盐的培养基上再生较慢，大部分外植体直径在4 mm以上，因此以直径超过4 mm的外植体比率作为衡量再生速度的标准之一。同时统计外植体的存活率（具有再生能力的绿色外植体块数／总外植体块数）和成苗率（再生形成小苗的外植体块数／总外植体块数）。用上述3个指标综合衡量愈伤组织的耐盐性。之后将所有再生形成的小植株转移到含1.0%NaCl的1／2MS培养基上进行生根培养。

1.6 数据差异显著性分析

试验数据分析采用SAS分析软件，Tukey多重比较法，5%水平差异。

2 结果与分析

2.1 辐射处理对愈伤组织再生的影响

2.1.1 愈伤组织再生能力比较 0 Gy60Coγ射线处理对愈伤组织再生分化成苗的速度有显著的促进作用（图1）。同对照相比，10 Gy辐射处理的愈伤组织再生4周后分化形成3个以上小苗的比率提高11.25%，但是再生率降低8.75%，2项指标均达到显著水平。不同辐射剂量对于直径超过5 mm的愈伤组织比率没有显著影响。

2.1.2 再生植株CAT、SOD、POD活性和脯氨酸含量变化 10 Gy60Coγ射线处理后，再生植株叶片中的CAT活性和脯氨酸含量分别比对照提高16.02%和1.20倍（图2A，D），均达到显著水平。而不同处理的SOD和POD活性没有显著差异（图2B，C），分别在2.74～2.78 U／（g FW·min）之间和12.77～13.09 U／（g FW·min）之间。

2.2 辐射处理的愈伤组织抗盐筛选

随着NaCl浓度的升高，外植体的生长速度（直径≥4 mm的外植体比率）和存活率呈逐渐下降的趋势（图3A，B），并且任意2种NaCl浓度之间的差异达到显著水平。与0 Gy相比，在含0.5%～2.0%NaCl的再生培养基上，10 Gy60Coγ射线处理的愈伤组织具有更快的生长速度和更高的存活率，说明愈伤组织的耐盐性有所提高。

不同NaCl浓度对于再生成苗率也有显著影响（图3C）。NaCl浓度为0%时，再生成苗率最高，为32.00%～35.20%。除此以外，10 Gy处理的愈伤组织在含1.0%NaCl的再生培养基上再生成苗率最高（9.60%），所获得的再生植株生长较快（图4A），在转移到含1.0%NaCl的生根培养基上后仍保持着旺盛生长（图4C）。未经辐射（0 Gy）的愈伤组织只在含0.5%和1.0%NaCl的再生培养基获得少量生长缓慢的再生植株（图4B）。当NaCl浓度提高到2.0%时，0和10 Gy处理的愈伤组织均没有形成再生植株。

图1 辐射处理对愈伤组织再生的影响Fig.1 Effects of different radiation treatments on regeneration of the calluses

3 讨论

辐射诱变结合离体培养定向筛选突变体是一种快速有效的育种方法。藏威等［17］通过60Coγ射线辐射诱变，采用稻瘟病菌（Pyriculariagrisea）粗毒素提取液作为选择压力，筛选出水稻（Oryzasativa）抗瘟突变体。甜菜（Betavulgaris）丛生芽经过γ射线辐射后，在含NaCl的培养基上筛选获得了耐盐性的甜菜幼苗［18］。通常认为，愈伤组织体细胞胚胎发生是单细胞起源的，因此以愈伤组织为辐射对象，通过定向筛选获得有利突变体的方法能够减少嵌合体的产生，获得稳定遗传的变异。本试验首次以沟叶结缕草胚性愈伤组织为试材，通过60Coγ射线处理，在含1.0%NaCl的再生培养基上，筛选出生长良好的抗性植株，在沟叶结缕草的辐射诱变和抗盐性筛选方面做出了初步探索。

图2 辐射处理对再生植株生理指标的影响Fig.2 Effects of different radiation treatments on physiological indexes in the regenerated plants

图3 不同辐射处理对愈伤组织耐盐性的影响Fig.3 Effects of different radiation treatments on salt tolerance of the calluses

图4 辐射处理的愈伤组织在含NaCl培养基上获得的再生植株Fig.4 Regenerated plants acquired from calluses in different radiation treatments on medium with NaCl

在先前的试验中，通过比较不同剂量（0，5，10，20，40 Gy）60Coγ射线对沟叶结缕草愈伤组织的影响，发现经过10和20 Gyγ射线处理后，愈伤组织的生长与再生速度均有明显提高。故本试验以10 Gy作为辐射剂量，在此基础上进行愈伤组织抗盐性研究。试验中，10 Gy60Coγ射线处理虽然使愈伤组织再生率有所降低，但是对愈伤组织的再生速度却有显著的促进作用，这与张慧琴等［19］关于草莓（Fragariaananassa）花药愈伤组织辐射研究的结果一致。同时，10 Gy辐射处理能大大提高再生植株叶片内的CAT活性和脯氨酸含量。而与之相对应的是辐射处理后愈伤组织对NaCl的抗性有显著增强。

盐胁迫条件下，植物细胞通过脯氨酸等小分子有机物参与渗透调节来维持低的细胞质渗透势，以利于水分的吸收，保证细胞正常的生理功能。在正常生长条件下，通过离体筛选获得的耐盐性三倍体狗牙根株系体内脯氨酸含量高于亲本，说明较高的脯氨酸含量能提高植物对盐害的适应能力，减少在盐胁迫下的伤害［6］。逆境条件下，植物细胞会积累大量活性氧（O2－、H2O2、OH－等），造成细胞膜脂过氧化反应，从而导致膜系统损伤和细胞氧化，使植物受到伤害［20］。为避免这种伤害，植物形成了内源保护系统，通过SOD、POD和CAT等重要的保护酶清除体内的活性氧，维持细胞的稳定和完整，提高对逆境的适应性［21］。与正常生长条件下的敏感栽培品种相比，水稻耐盐性品种具有较高的CAT活性，而在盐胁迫条件下，耐盐性或敏感性品种的CAT活性均有显著增加［22］。而Lu等［6］的研究也表明，2个离体筛选获得的耐盐性三倍体狗牙根株系，在盐胁迫条件下具有较高的CAT活性，说明CAT活性与植物的耐盐性呈正相关。因此，辐射处理的愈伤组织抗盐性增强，与辐射再生植株CAT活性和脯氨酸含量的提高有着密切关系。

试验中，经过10 Gyγ射线处理的愈伤组织，在含NaCl的再生培养基上能够获得生长旺盛的抗性植株。这些植株在转移到含1.0%NaCl的生根培养基上后，依然表现出良好的长势和较强的抗性。这说明，辐射诱变结合离体筛选在沟叶结缕草耐盐性育种方面是一种可行的方法。

［1］Larkin P J，Scowcroft W R.Somaclonal variation－a novel source of variability from cell cultures for plant improvement［J］.Theoretical and Applied Genetics，1981，60：197－214.

［2］Evans D A，Sharo W R，Medina－Filho H P.Somaclonal and gametoclonal variation［J］.American Journal of Botany，1984，71：759－774.

［3］Chai M L，Lee J M，Park M H，etal.In vitro selection for large patch resistance in zoysiagrass［J］.Journal of The Korean Society for Horticultural Science，2001，42（3）：249－253.

［4］Lu S Y，Wang Z C，Peng X X，etal.An efficient callus suspension culture system for triploid bermudagrass（Cynodontransvaalensis×C.dactylon）and somaclonal variations［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2006，87：77－84.

［5］Lu S Y，Chen C H，Wang Z C，etal.Physiological responses of somaclonal variants of triploid bermudagrass（Cynodontransvaalensis×Cynodondactylon）to drought stress［J］.Plant Cell Reports，2009，28：517－526.

［6］Lu S Y，Peng X X，Guo Z F，etal.In vitro selection of salinity tolerant variants from triploid bermudagrass（Cynodontransvaalensis×C.dactylon）and their physiological responses to salt and drought stress［J］.Plant Cell Reports，2007，26：1413－1420.

［7］柴明良，钮友民，刘嘉蓉，等.经辐射的“猎狗”苇状羊茅种子播种、萌发试验及试管培养研究［J］.草业科学，1997，14（6）：66－70.

［8］郭爱桂，刘建秀，郭海林，等.辐射技术在国产狗牙根育种中的初步应用［J］.草业科学，2005，17（1）：45－47，59.

［9］王文恩，包满珠，张俊卫.60Co－γ射线对日本结缕草干种子的辐射效应研究［J］.草业科学，2009，26（5）：155－160.

［10］刘一明，程凤枝，王齐，等.四种暖季型草坪植物的盐胁迫反应及其耐盐阈值［J］.草业学报，2009，18（3）：192－199.

［11］张永峰，殷波.混合盐碱胁迫对苗期紫花苜蓿抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响［J］.草业学报，2009，18（1）：46－50.

［12］陈静波，阎君，姜燕琴，等.暖季型草坪草优良选系和品种抗盐性的初步评价［J］.草业学报，2009，18（5）：107－114.

［13］李国平，杨鹭生，胡文英，等.沟叶结缕草的组织培养和无性系的建立［J］.林业科学研究，2005，18（5）：541－545.

［14］Dhandapani M，Hong S B，Aswath C R，etal.Regeneration of zoysia grass（ZoysiamatrellaL.Merr.）cv.Konhee from young inflorescences and stem nodes［J］.In Vitro Cellular ＆ Developmental Biology－Plant，2008，44：8－13.

［15］高俊凤.植物生理学实验指导［M］.北京：高等教育出版社，2006：144－148.

［16］周艳虹，喻景权，钱琼秋，等.低温弱光对黄瓜幼苗生长及抗氧化酶活性的影响［J］.应用生态学报，2003，14（6）：921－924.

［17］臧威，张淑园，张国民，等.用Coγ射线诱导水稻抗瘟突变体的筛选［J］.核农学报，2008，22（3）：248－252.

［18］Yang A，Zhu L，Zhao S L，etal.Induction of multiple bud clumps from inflorescence tips and regeneration of salt－tolerant plantlets in Beta vulgaris［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2004，77：29－34.

［19］张慧琴，谢鸣，陈昆松，等.60Co辐照对草莓花药愈伤组织诱导和分化的影响［J］.核农学报，2007，21（3）：229－231.

［20］姜卫兵，高光林，俞开锦，等.水分胁迫对果树光合作用及同化代谢的影响研究进展［J］.果树学报，2002，19（6）：416－420.

［21］李会云，郭修武.盐胁迫对葡萄砧木叶片保护酶活性和丙二醛含量的影响［J］.果树学报，2008，25（2）：240－243.

［22］Vaidyanathan H，Sivakumar P，Chakrabarty R，etal.Scavenging of reactive oxygen species in NaCl－stressed rice（OryzasativaL.）－differential responses in salt－tolerant and sensitive varieties［J］.Plant science，2003，165：1141－1418.