头孢克洛片微生物限度检查方法的探讨

黄新兰 李雪兰 季红兰

江苏省扬子江药业集团有限公司（225321）

头孢克洛片临床主要用于治疗呼吸道、泌尿道和皮肤组织感染以及中耳炎[1]等，该药物对革兰阴性菌和阳性菌都具有抗菌作用。本文采用了多种方法消除该药物的抗菌活性，按要求将5株试验菌：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉加入头孢克洛片中。细菌采用离心沉淀加薄膜过滤法，霉菌、酵母菌采用常规法，控制菌宜采用离心沉淀、培养基稀释加薄膜过滤法，对各试验菌的回收率进行逐一验证，从而建立了头孢克洛片的微生物限度的检查方法。

1 仪器与试药

HTY-2000A型智能集菌仪（泵速设为160r/min）、HTY-K型培养器专用振荡仪、HTY型反复使用全封闭集菌培养器 （杭州高得泰林生物技术设备有限公司）、LRH-250生化培养箱（上海索普仪器有限公司）、KA-1000型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

试验菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]（均来源于中国药品生物制品检定所，传种代数为第3代）。

胆盐乳糖培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基、改良马丁液体培养基、4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸培养基（均来源于北京三药科技开发公司）、pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（扬子江药业集团有限公司输液制剂车间配制）；头孢克洛片（扬子江药业集团有限公司，批号08052501、08053001、08053002规格：0.25g）。

2 方法[2-4]与结果

2.1 菌液的制备

将上述菌种按2005年版《中国药典》二部 附录Ⅺ J菌液制备方法制成所需浓度的菌悬液和孢子悬液。

2.2 供试液制备

取供试品5g，加入约45℃的pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，保温振摇使混匀，作为1∶20的供试液。

取1∶20的供试液10mL至离心管中，以500转/min离心5min，取上清液至另一离心管中，加pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10mL，混匀，作为离心后1∶20的供试液。

2.3 细菌、霉菌和酵母菌检查方法的验证

2.3.1 细菌检查方法的验证

试验组：取离心后1∶20的供试液，注入反复使用全封闭集菌培养器（含有100mL的pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）中，振摇过滤，用pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗300mL（50mL/次），在最后一次冲洗液中分别加入50～100cfu的菌悬液，取出滤膜，菌面朝上置相应的培养基贴膜培养，置规定的温度培养至规定的时间，逐日观察结果，测定供试品本底菌数。

表1 微生物验证方法试验结果（回收率%）

表2 大肠埃希菌控制菌验证方法试验结果

菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数。

供试品对照组：照试验组制备项下操作，不加菌悬液，作为供试品本底菌数。

稀释剂对照组：取45℃的pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，混匀，取10mL至离心管中，以500转/min离心5min，取上清液至另一离心管中用pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10mL，混匀，用pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗300mL（50mL/次），在最后一次冲洗液中分别加入50～100cfu的菌悬液，取出滤膜，菌面朝上置相应的培养基贴膜培养，置规定的温度培养至规定的时间，逐日观察结果。

2.3.2 霉菌和酵母菌检查方法的验证

试验组：取1∶20的供试液各1mL，注入平皿中，在每个平皿中分别加入1mL菌悬液，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基15～20mL，混匀，凝固，于23～28℃倒置培养，以72h点计菌落数。

菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数。

供试品对照组：照试验组制备项下操作，不加菌悬液，作为供试品对照组。

将上述细菌培养皿置于30～35℃倒置培养48h；霉菌及酵母菌培养皿置于23～28℃倒置培养72h，分别点计菌落数并记录。

2.4 控制菌检查方法的验证

供试液的制备：同“2.2”离心后1∶20的供试液。

试验组：取离心后1∶20的供试液20mL，至250mL pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇过滤，然后用300mL 45℃pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液振荡冲洗，每次50mL，在最后一次过滤液中加入10～100cfu的大肠埃希菌菌悬液，过滤后取出滤膜，置250mL锥形瓶中，加入约200mL的胆盐乳糖增菌培养基，于35～37℃培养18～24h，必要时可延长至48h。

阴性菌对照组：取上述1∶20的离心供试液20mL，至100mL pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇过滤，然后用300mL 45℃pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液振荡冲洗，每次50mL，在最后一次过滤液中加入10～100cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液，过滤后取出滤膜，置250mL锥形瓶中，加入约200mL的胆盐乳糖增菌培养基，于35～37℃培养18～24h，必要时可延长至48h。

阳性对照试验：取大肠埃希菌菌悬液1mL，置250mL锥形瓶中，加入约200mL的胆盐乳糖增菌培养基，于35～37℃培养18～24h，必要时可延长至48h。

阴性对照试验：取pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液20mL，置250mL锥形瓶中，加入约200mL的胆盐乳糖增菌培养基，于35～37℃培养18～24h，必要时可延长至48h。

检查：取上述试验液的培养物各0.2mL，接种至含5mL MUG培养基的试管内，培养，于5、24h在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。

2.5 验证结果

见表1和表2。

3 讨 论

方法验证所用菌株选择的原则：选择代表性、 普遍性、低或非致病性的标准菌株（或该药品中常见的污染菌）。菌种的要求：传代不得超过 5代，采用适宜的方法保存，应防止变异。菌液浓度也是影响方法验证的一个重要因素，浓度应适中，控制在50～100cfu，实际工作中，发现试验用的50～100cfu菌液对温度比较敏感，过高的温度影响菌液的活性，造成菌回收率的不准确性，进而影响方法的确定。所以在操作中应采用当日新鲜制备的菌液，并注意周围环境温度的控制。

本品是具有强抗菌作用的抗生素，经多次试验，细菌宜采用离心沉淀加薄膜过滤法；霉菌、酵母菌采用常规法；控制菌宜采用离心沉淀、培养基稀释加薄膜过滤法，以消除抑菌活性。薄膜过滤所用的冲洗量以200、300、400mL进行研究验证，最后确定 300mL冲洗量可达完全消除抑菌活性的作用，菌回收率均可达标。

[1]中华人民共和国药典临床用药须知[S].2005年版.化学药和生物制品卷.

[2]李惠娥,张丹,由亚宁,等.14种化学药品微生物限度检查方法验证结果及分析[J].西北药学杂志,2007,22(6):325-327.

[3]李惠娥,由亚宁,衷红梅,等.复方头孢克洛颗粒微生物限度检查方法的探讨[J].药物分析杂志,2007,27(7):1086-1088.

[4]中国药典[S].2005年版.二部.附录93-98.