嗜酸乳杆菌-1.557培养条件及培养基成分优化研究

金桩 彭健 胡新文 林声汉 马燕

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）属于乳杆菌属，是肠道重要的益生菌，对维持胃肠道的生理功能有重要作用，被广泛用于发酵食品与医药行业。但在饲料生产和养殖业中应用报道较少，为了探讨嗜酸乳杆菌在畜牧业生产上的标准化应用，本研究以产酸能力较强的嗜酸乳杆菌-1.557菌株为试验菌，优化了其培养条件和培养基成分，给乳酸菌发酵饲料的标准化生产提供依据。

1 材料和方法

1.1 菌种

嗜酸乳杆菌，由海南青牧原实业有限公司提供。

1.2 试验设备

振荡培养箱(SHZ-A型，上海跃进医疗机械厂生产)、生化培养箱 (DHP120型，上海实验仪器总厂生产)、高压灭菌器(MLS-3750型，日本三洋电子有限公司生产)、磁力搅拌器(JB-3型，上海智光仪器仪表有限公司生产)、便携式pH计(PHB-3型，上海伟业仪器厂生产)、生物洁净工作台(SA-960-2型，上海上净净化设备有限公司生产)、721可见紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司生产）。

1.3 培养基

种子培养基（MRS培养改良基）：蛋白胨10 g、酵母提取物 5 g、牛肉膏 10 g、葡萄糖 20 g、乙酸钠 5 g、柠檬酸铵 2.15 g、Tween801 ml、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、K2HPO42 g、琼脂粉 17 g、水 1000 ml。

1.4 培养条件优化

菌种活化：从冰箱中取出嗜酸乳杆菌-1.557斜面菌种，室温静置40min。然后从中取两环菌种接于装有10ml液体种子培养基试管中，37℃静止培养12 h，备用。

1.4.1 静置培养和摇床培养对比

按1.0%接种量将活化的种子接种于装有100 ml MRS改良液体培养基的250 ml三角瓶中，37℃静置培养和60 r/min振荡培养48 h，每隔12 h取1次样(先摇匀后取样)，在610 nm处（以下同）测定培养液OD值。

1.4.2 培养基起始pH值的筛选

以6 mol/l的HCl和40%NaOH溶液将MRS改良培养基的起始pH值分别调节为4.5、5.5、6.5、7.5和8.5，接入1.0%活化菌液，37℃下恒温培养24 h，测定OD值。

1.4.3 培养温度的筛选

将100 ml的MRS改良液体培养基中接入1.0%的菌液，分别于 30、35、40、45 ℃下恒温培养 24 h，测定OD值。

1.4.4 接种量的确定

按 0.5、1.0、1.5、2.0%接种量接活化菌液，37 ℃下静置培养24 h，测定OD值。

1.5 对培养基成分的优化（见表1）

表1 L16（45）正交试验设计

蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏和葡萄糖是影响培养基的主要成分。因此，本试验设计L16（45）正交试验，确定嗜酸乳杆菌-1.557最适培养基成分。

1.6 测定方法

OD值测定采用胡俊等（2007）方法；活菌数测定参考郭兴华（2002）方法。

2 结果与分析

2.1 静置培养和摇床培养

不同时间取样测定培养液OD610值，结果见表2、图1。

表2 嗜酸乳杆菌-1.557静置培养和摇床培养下不同取样时间OD610值对比

图1 乳酸杆菌-1.557静置培养和摇床培养对比

从表2和图1可知，试验刚开始时两种培养方法的OD610值一样，随着培养时间的延长逐渐变大，0～12 h时间段迅速生长，12～24 h时间段缓慢生长，到24 h时临近顶峰值，而后进入衰退期；整个培养阶段，静置培养优于摇床培养。这说明嗜酸乳杆菌-1.557的最适培养时间为24 h，并且该菌是兼性厌氧菌。这符合乳酸菌多数属于厌氧菌或微好氧菌的结论。

2.2 培养基起始pH值的确定（见表3）

从表3可以看出，嗜酸乳杆菌-1.557对酸碱环境的适应能力较强，pH值4.5～8.5都可以生长。当pH值小于5.5或大于7.5时生长较慢，而在pH值5.5～7.5范围内生长较快。pH值5.5时OD610值达到最高值1.815，即培养基的最适初始pH值为5.5。大量研究表明，乳酸菌在pH值4.5～8.0范围内生长良好，本试验结果在此范围内。

表3 培养基不同起始pH值对嗜酸乳杆菌-1.557生长的影响

2.3 培养温度的确定（见表4）

表4 不同培养温度对嗜酸乳杆菌-1.557生长的影响

从表4可以看出，培养温度在30℃时OD610值为1.826，到35℃时提高到1.861，而超过35℃后，随着温度的升高OD610值有下降趋势，到45℃时仅为0.122。说明嗜酸乳杆菌-1.557最适培养温度为35℃，而且在高温条件下嗜酸乳杆菌-1.557基本不生长。单春乔等（2009）对嗜酸乳杆菌SR-1菌株分泌类细菌素的最适培养条件进行了优化研究，该菌株适宜温度为37℃。奚灏锵等（2009）研究结果说明其保存的嗜酸乳杆菌适宜温度为36℃。熊素玉等（2006）用改良MC培养基为载体，做了分离到的24株乳酸菌最适条件研究，发现最适生长温度大概在40℃左右，但温度的范围在各菌株间略有差异。

2.4 接种量的确定（见表5）

表5 不同接种量对嗜酸乳杆菌-1.557生长的影响

从表5可以看出，随着接种量的增加，OD610值也逐渐变大。当接种量为0.5%时OD610值为1.319；接种量为1.0%时OD610值提高到1.812，有明显升高。而1.0、1.5、2.0%的接种量菌液OD610值差异不明显，从生产成本考虑本次试验采用了1.0%的接种量。李剑芳等（2003）通过正交设计试验确定最优发酵条件是乳酸菌接种量为1%；邵亚东等（2007）为制备高浓度乳酸菌发酵剂，用1%接种量可以使乳酸菌活菌数的对数值达到 8～9。

2.5 最适培养基成分的确定（见表6）

从表6可以看出，在最佳条件（温度35℃，时间24 h，接种量为1.0%）下，组合A1B4C4D4（蛋白胨6 g、酵母提取物6 g、牛肉膏12 g、葡萄糖22 g）测出的OD610值最大，即1.870。但经过统计分析得出，嗜酸乳杆菌-1.557最佳培养基成分组合为A3B4C4D1（蛋白胨10 g、酵母提取物6 g、牛肉膏12 g、葡萄糖16 g）。因为该理论条件下的组合不在实际操作组合，所以需要再进行一次验证试验。试验结果表明，A3B4C4D1组OD610值为 1.889，大于 A1B4C4D4组 合 OD610值（1.870），即嗜酸乳杆菌-1.557最适生长培养基成分为蛋白胨10 g、酵母提取物6 g、牛肉膏12 g、葡萄糖16 g，影响因素次序为酵母提取物＞牛肉膏＞蛋白胨＞葡萄糖。

表6 培养基成分正交试验结果

2.6 嗜酸乳杆菌-1.557生长曲线（见表7和图2）

表7 嗜酸乳杆菌-1.557不同培养时间OD610值和活菌数

图2 嗜酸乳杆菌-1.557生长标准曲线

从表7和图2可知，随着培养时间的延长，菌液OD值和活菌数都得到提高。当培养24 h时，菌液OD值达到1.889，活菌数达到2.9×1010cfu/ml。奚灏锵等对一株嗜酸乳杆菌进行优化研究，活菌数也达到了1010cfu/ml，与本试验结果相符。

在生产菌种和乳酸菌制剂时，菌液中乳酸菌数量的多少直接影响到产品的总体质量。乳酸菌菌体小，在光学显微镜下不易直接计数，大多数采用平板涂布培养法。而平板涂布培养法培养的时间较长，不适于生产中应用，所以，平板涂布培养法可以用于终端产品的检测，但对生产过程的监控起不到作用。制作嗜酸乳杆菌-1.557生长标准曲线，采用分光光度计测定OD值，简单方便，可以随时取样检测培养液活菌数，对生产进行全过程监控，随时调整培养条件，为保证产品质量具有重要意义。

3 结论

3.1 嗜酸乳杆菌-1.557最佳培养条件为：温度35℃、培养时间24 h、接种量1.0%、培养基起始pH值5.5。

3.2 优化培养基成分为蛋白胨10 g、酵母提取物6 g、牛肉膏12 g、葡萄糖16 g、乙酸钠5 g、柠檬酸铵 2.15 g、Tween801 ml、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、K2HPO42 g、琼脂粉 17 g、水 1000 ml。

3.3 优化培养后菌液OD610值达到1.889，活菌数达到 2.90×1010cfu/ml。

11篇，刊略，需者可函索）