养殖江团体色改变的生化分析

陶青燕 张勇 李鑫 罗国强

从2002年起，各类无鳞鱼体色改变的现象在水产养殖行业呈不断高发的趋势，一方面由于其发病迅速，明显而迅速成为人们关注的热点；另一方面，由于其发病规律性较差，难于复制等特征，目前还未确定出其致病因子的分类。变色鱼的主要特征为黑色素的丢失，并因鱼的品种不同而表现出各种奇异的体色。由于变色鱼从视觉上难以被消费者接受，从而给水产养殖，特别是特种水产养殖带来巨大的经济损失。目前关于养殖鱼体体色改变的原因还不甚清楚，其系统的研究仅见于变色鱼鳞片黑色素细胞的显微观察分析，而对于生产中变色频率最高的无磷鱼体色改变的生化研究还尚未见开展。江团学名长吻鮠，是我国特有的优良无鳞鱼品种，具有肉质鲜美，经济价值高的特性。本研究拟采集变色江团和正常体色江团就可能影响黑色素形成的相关因子进行比较研究，以探讨引起无鳞鱼体色改变的内在生化机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在成都周边渔场购买体重为250 g左右的健康江团以及正处于体色异常阶段的变色江团各5尾。其中变色江团体表黑色素部分脱落，呈斑块状，正常江团体表色素分布均匀，自然，呈灰白色。

1.2 样品采集

分别于尾静脉处取各试鱼的血液3 ml，4℃离心（3000 r/min,10 min）取血清，-20℃下保存待用。取各试鱼肝胰脏，冰浴匀浆后放入液氮中保存待用。用手术刀取鱼体背鳍后侧背中线附近2×2 cm2的皮肤及鱼体右侧腹鳍后侧2×2 cm2侧的皮肤。鱼皮剥离肌肉后，按照1：10(W/V)溶于pH值7.4冷的0.1 M的PBS缓冲液中冰浴匀浆，4℃培养3～12 h,在4℃下，12000 r/min,离心30 min，取得上清液，得到皮肤抽提液，冻存于-70℃备用。

1.3 指标测定

肝脏中总蛋白含量的测定采用考马斯亮兰法试剂盒（天根生化科技公司生产）；肝脏中还原型谷胱甘肽（GSH）的测定参见还原型谷胱甘肽试剂盒操作方法（南京建成生物工程研究所生产）；血清丙二醛（MDA）的测定参见MDA试剂盒操作方法（南京建成生物工程研究所生产）；血清铜蓝蛋白的测定参见铜蓝蛋白试剂盒操作方法（南京建成生物工程研究所生产）。

酪氨酸酶活性分析参照Zhang等(2000)[1]的方法进行。酶的活力单位（unit）规定为，在试验条件下，每分钟每毫克蛋白OD值增加0.001规定为一个酶活力单位。抽提液中蛋白浓度的测定同肝蛋白。

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS软件进行统计分析，结果用平均数±标准差表示，并用T-Test进行显著性检验。

2 结果与分析（见表1、表2、表3）

表1 正常及变色江团肝脏蛋白、肝脏GSH的含量

从表1可以看到，正常组肝蛋白的含量显著高于变色组（P＜0.05）,而正常组肝中GSH含量显著低于变色组（P＜0.05）。

表2 正常及变色江团血清铜蓝蛋白及MDA含量

从表2可以看出，正常组血清中铜蓝蛋白的含量与变色组之间不存在显著的差异，但变色组血清中MDA的含量极显著的高于对照组（P＜0.01）。

表3 正常及变色江团皮肤酪氨酸酶活性

从表3中可以看出，正常及变色江团皮肤中酪氨酸酶的活性存在显著差异，同一部位正常组明显高于变色组，其背鳍后沿和腹鳍后沿皮肤处的酶活力均为变色组的3倍。

3 讨论

我们在生产实践中发现铜离子在治疗无鳞鱼的变色方面表现出不稳定的疗效，而铜是酪氨酸酶的辅基，对于黑色素的形成具有重要作用，因此，无鳞鱼体色的改变是否是由铜缺乏引起的，目前还未见报道。但本试验结果表明，正常江团与变色江团的血清铜蓝蛋白的含量之间不存在显著差异，并且铜离子广泛存在于养殖水体中。在常规养殖条件下，未见鱼体铜缺乏症的发生。这就基本排除了鱼体因铜缺乏导致黑色素合成障碍的可能性。

已知MDA是脂质过氧化的最终分解产物之一，其含量能直接反映机体脂质过氧化程度，并间接反映细胞损伤程度。而GSH作为机体重要的抗氧化防御物质，在机体处于高氧化应激状态时能代偿性的升高[2]。从本试验结果可以看出，变色鱼体内MDA的含量极显著的高于对照组，并且变色鱼肝脏中GSH含量的代谢性增高以及肝脏蛋白质含量的下降均与实验室条件下氧化损伤的生化改变相一致。早在1974年Murai[3]等就观察到氧化鱼油可使斑点叉尾鮰的皮肤色泽变浅，即氧化油脂可以影响黑色素的代谢。但整体皮肤颜色的变浅与局部或整体皮肤黑色素的丢失是否是同一问题的不同表现形式目前还尚不清楚。

已知皮肤黑色素代谢的异常可能是来源于合成功能的抑制或降解功能的亢进。在本研究中发现，变色鱼相对于正常鱼其皮肤中色素合成的关键酶活性显著下降，这与叶元土等（2006）[4]观察到变色鱼鳞片中出现大量黑色素细胞凋亡的现象相吻合。

目前尚有不少水产工作者认为，变色鱼仅在皮肤有病理变化而对鱼体没有损伤，从本试验结果可以看出，变色鱼肝脏蛋白的含量显著的低于正常组，表明肝脏存在严重的损伤。同时在临床上可以看到部分变色鱼的肝脏呈豆腐渣样，并且鱼体体表有比较严重的出血现象，若未及时治疗，病程较长的池塘也会出现大规模的死亡。

在近年来的分析讨论中，不少研究者将牙鲆等海水鱼的白化与无鳞鱼的体色改变在一定程度上划了等号。但在我们的研究及实践中发现，这两者之间是存在较大差异的。虽然同为皮肤色素异常，但鲆类的白化往往发生在幼鱼阶段，其发病过程可能涉及细胞的分化，并且这种病理改变往往是不可逆的，相对于正常皮肤，白化的皮肤往往具有更高的酪氨酸酶活性[5]。而近年来多发的无鳞鱼变色可发生于养殖鱼类的各个阶段，并且在生产实践中表现出明显的可逆性，其黑色素的减少与皮肤中酪氨酸酶活性降低直接相关。因此，用鲆类白化的研究成果来分析无鳞鱼的变色可能是欠妥的。

4 结论

本研究结果表明，变色江团相对于正常江团体内铜水平正常，变色江团存在严重的氧化损伤，具体表现为血浆MDA水平的上升和GSH的代偿性升高，而变色江团皮肤酪氨酸酶活性的显著下降并导致黑色素合成抑制是导致变色江团皮肤黑色素丢失的直接生化原因。

[1]Zhang S C,Li G R..Presence of phenoloxidase and prophenoloxidase in epidermal cells and the epidermis mucus of the lancelet branchiostoma belcheritsingtauense[J].OPHELIA,2005,2(3):207-212.

[2]黄凯，阮栋俭，战歌，等.氧化油脂对奥尼罗非鱼生长和抗氧化性能的影响[J].淡水渔业,2006,36（6）：21－24.

[3]Murai T,Andrews J W.Interactions of dietary a-tocopherol,oxidized menhaden oil and ethoxyquin on channel catfish(Ictalurus punctatus)[J].J.Nutr.,1974,104:1416-1431.

[4]叶元土,郭建林,萧培珍,等.养殖武昌鱼体色与鳞片黑色素细胞初步观察[J].饲料工业,2006（22）.

[5]黄冰.大菱鲆白化病白化机理研究[D].中国海洋大学，2006.