IL-15对CIK细胞的NKG2D表达及杀伤活性的影响

李晓峰 孙伟芬 黄 苹 刘 玉, 黄伟贤 苏 齐 陈 强 叶韵斌

细胞因子诱导杀伤细胞（cytokine induced killers，CIK）是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养而获得的一群异质细胞群，因其兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非主要组织相容抗原（MHC）限制性杀瘤特点，从而成为肿瘤过继免疫治疗的重要手段之一[1]。已有研究提示，CIK细胞的杀伤机制可能是由NKG2D介导的细胞毒效应，即通过CIK细胞上的活化性受体-NKG2D与肿瘤细胞上相应的配体（NKG2DL）的相互作用，启动杀伤效应[2]。本研究通过在常规培养体系中加入IL-15诱导CIK细胞，并选择细胞膜高表达MHCⅠ链相关分子A （MHC classⅠchain-related gene A，MICA）和不表达MICA的两种乳腺癌细胞作为靶细胞，初步观察IL-15对CIK细胞NKG2D的表达及体外杀伤活性的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

人乳腺癌细胞株SKBr-3、MDA-MB-231（购自上海细胞所）本室常规培养。我们之前研究表明，MDA-MB-231细胞膜高表达MICA，而SKBr-3细胞膜不表达MICA[3]。

淋巴细胞分离液（Ficoll，相对密度1.077，中国医学科学院天津血液研究所），D-PBS及人淋巴细胞培养液KBM-551（日本Takara公司），IL-1α（美国Peprotech公司），IL-2（双鹭制药有限公司），IFN-γ（丽珠生物有限公司），IL-15（美国Amoytop Biotech公司），CD3单抗、CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PE、CD56-PE、purified-NKG2D单抗，NKG2D-APC及羊抗鼠IgG1-APC（均美国BD公司）。胰蛋白酶（美国Sigma公司），胎牛血清（Hyclone公司），RPMI-1640、MEM、DMEM培养基（美国Gibco公司），MTT（美国Biomo公司）。

1.2 CIK细胞的制备

共有15例健康供血者的外周血纳入研究，将每例健康供血者的外周血分为2份，分别用于常规培养组（常规组）及常规培养+IL-15组（IL-15组）的培养，每组15份。参照并稍调整本实验室建立的CIK细胞培养方法[4]，将抗凝外周血用淋巴细胞分离液经Ficoll密度梯度离心分离，吸取单个核细胞层，D-PBS洗涤3遍，用人淋巴细胞培养液KBM-551调整细胞浓度为1.0×106/mL，移至经CD3单抗包被的细胞培养瓶中，加入IFN-γ 1000U/mL，置于37℃ 5%的CO2培养箱条件下培养。

1.2.1 常规组

24h后加入IL-1α 100U/mL、CD3单抗50ng/mL、IL-2 500U/mL，此后每隔3d换液1次，并补加CD3单抗、IL-2。1.2.2 IL-15组

24h后加入IL-1α 100U/mL、CD3单抗50ng/mL、IL-2 500U/mL、IL-15 20ng/mL，此后每隔3d换液1次，并补加CD3单抗、IL-2及IL-15。

1.3 检测CIK细胞的NKG2D表达

取培养第0、7、14、21、28天的CIK细胞悬液，经PBS洗涤2次后调整细胞浓度为1×105/mL，分别标记一种或多种单克隆抗体CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PE、CD56-PE、NKG2D-APC及相应的同亚型对照IgG1，于室温暗处孵育15min，PBS洗涤去除多余的抗体，上流式细胞仪（美国BD公司）检测。

1.4 封闭CIK细胞NKG2D受体

取14、21d的常规组、IL-15组CIK细胞悬液，10μL purified-NKG2D单抗（终浓度10 μg/mL）封闭5×105个/mL CIK细胞上NKG2D，冰水浴30min，PBS洗涤两遍，并用NKG2D-APC标记，以流式细胞术检测封闭效果。

1.5 MTT法检测CIK细胞的杀伤活性

按效靶比为10∶1，取培养第14、21天的常规组、IL-15组两种CIK细胞，细胞浓度为1×105（100μL），分别与对数生长期的MDA-MB-231、SK-Br3细胞[调整肿瘤细胞浓度为1×104（100μL）] 混合，加入96孔板中，每组样品设3个复孔；将培养板置饱和湿度为37℃、5%CO2孵箱内培养20h，每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，继续培养4h，而后离心，弃上清，每孔再加入100μL的0.04N HCL酸化异丙醇，用滴头轻轻吹打细胞，再置于振荡器上振荡1min，使黑蓝色结晶完全溶解。570nm波长测OD值，取3个平行孔平均OD值计算结果。杀伤活性（%）=[1—（实验孔OD值—效应孔OD值）/靶细胞孔OD值] ×100%。

1.6 统计学方法

采用SPSS16.0软件包建立数据库及统计分析，计量资料用±s表示，正态分布的计量资料作t检验，方差齐性检验用Levene检验。组间比较采用两样本t检验。

2 结 果

2.1 CIK细胞中NKG2D的表达

2.1.1 NKG2D在T细胞亚群中的表达

表1 NKG2D在T细胞亚群上的表达 [（±s）%]

*与常规组比，P＜0.05

+上的表达 在CD8+上的表达天数(d) 常规组 IL-15组 常规组 IL-15组培养 在CD4 0 3.05±1.73 3.23±1.16 39.54±5.52 40.32±4.31 7 4.12±1.06 4.94±1.58* 47.19±5.07 52.45±6.96*14 4.75±1.32 6.23±2.14* 57.38±7.75 64.89±10.62*21 5.39±1.98 7.57±1.94* 68.14±7.39 77.57±6.57*28 6.08±1.72 7.83±2.25* 80.25±6.64 88.69±7.35*

NKG2D在CD3CD56双阳性细胞上呈高表达，两种培养方法中NKG2D表达率均持续升高，而IL-15组升高的速率要高于常规组，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。同样的NKG2D表达升高趋势见于培养中总的CIK细胞群上，在培养后的不同时间点检测IL-15组的NKG2D表达水平均要高于同期的常规组的NKG2D表达，两组差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。提示IL-15可以进一步促进CC这种NK样T细胞及总CIK细胞群上NKG2D的表达。

表2 NKG2D在C和总CIK细胞上的表达 [（±s）%]

*与常规组比，P＜0.05

+上表达 在总CIK细胞上的表达常规组 IL-15组 常规组 IL-15组0 34.42±3.43 35.57±3.22 20.86±6.12 21.53±6.53 7 45.37±4.15 51.76±5.69* 26.95±3.25 32.03±3.14*14 67.82±5.43 78.71±6.14* 40.55±4.23 47.35±5.72*21 80.39±6.61 91.43±4.73* 64.08±5.28 75.23±5.35*28 91.75±2.64 96.31±1.95* 77.97±5.15 89.72±6.24*培养天数(d) 在CD 3+CD56

2.2 CIK细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性

2.2.1 CIK细胞对乳腺癌细胞株MDA-MB-231的杀伤活性

当效靶比为10∶1时，常规培养14、21d的CIK细胞对乳腺癌MDAMB-231细胞的杀伤活性为（56.33±6.68）%、（62.19±6.75）%，而加入IL-15诱导后的CIK细胞对MDA-MB-231的杀伤活性为（68.25±7.27）%、（77.33±7.69）%，显著高于常规组（P＜0.05）。用抗体封闭了CIK细胞的NKG2D后，两组CIK细胞对该肿瘤细胞的杀伤活性大幅下降，降幅均在50%左右，但IL-15组的杀伤活性仍高于常规组，见表3。提示IL-15可以增加CIK细胞对MDA-MB-231肿瘤细胞杀伤活性，CIK细胞的NKG2D在高表达NKG2D配体的肿瘤细胞杀伤中起重要的作用。

表3 CIK细胞对MDA-MB-231肿瘤细胞的杀伤活性 [（±s）%]

表3 CIK细胞对MDA-MB-231肿瘤细胞的杀伤活性 [（±s）%]

*与常规组比，P＜0.05

培养14d 培养21d常规组 IL-15组 常规组 IL-15组不封闭 56.33±6.68 68.25±7.27* 65.19±6.75 77.33±7.69*封闭NKG2D 28.73±4.24 32.45±4.08* 33.46±4.31 38.27±4.27*

2.2.2 CIK细胞对乳腺癌细胞株SKBr-3的杀伤活性

当效靶比为10∶1时，常规培养14、21d的CIK细胞对乳腺癌SKBr-3细胞的杀伤活性为（33.56±5.24）%、（40.78±3.73）%，而加入IL-15诱导后的CIK细胞对MDA-MB-231的杀伤活性为（39.22±5.29）%、（45.88±5.46）%，显著高于常规组（P＜0.05）。封闭了CIK细胞的NKG2D后，两组CIK细胞对该肿瘤细胞的杀伤活性仅稍微下降，见表4。提示IL-15可以增加CIK细胞对SKBr-3肿瘤的杀伤活性，而CIK细胞的NKG2D对低表达NKG2D配体的SKBr-3细胞的杀伤影响不大。

表4 CIK细胞对SKBr-3肿瘤细胞的杀伤活性 [（±s）%]

表4 CIK细胞对SKBr-3肿瘤细胞的杀伤活性 [（±s）%]

*与常规组比，P＜0.05

培养14d 培养21d常规组 IL-15组 常规组 IL-15组不封闭 33.56±5.24 39.22±5.29* 40.78±3.73 45.88±5.46*封闭NKG2D 30.68±4.40 34.67±5.12* 37.22±4.15 40.26±3.83*

3 讨 论

IL-15是一种功能多样的细胞因子，是体内外造血前体细胞向NK细胞定向发育的决定性因子，具有促进NK细胞的增殖，上调NK的细胞毒活性，促进NK细胞分泌各种细胞因子参与免疫调节和趋化作用[5,6]。Roberts等[7]证实IL-15还可以上调细胞毒杀伤淋巴细胞（CTLs）表面的NKG2D受体表达并增加NKG2D介导的细胞毒活性。我们研究结果提示：与传统的CIK细胞培养方法相比，加入细胞因子IL-15诱导的CIK细胞具有更强的增殖能力，能增加主要效应细胞-CD3CD56双阳性的比例（另文报道），还可以明显上调T淋巴细胞亚群、CC细胞及总CIK细胞上NKG2D的表达。

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