肺炎链球菌耐药性检测及其对大环内酯类抗生素耐药机制的研究*

潘方平,吴璐怡,叶云飞,孙爱华

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是人类细菌性肺炎的主要病原体,也可引起脑膜炎、败血症的中耳炎等疾病〔1〕。近年来,许多国家和地区对β-内酰胺类及大环内酯类抗生素耐药的肺炎链球菌菌株流行日益广泛,导致相关疾病发病率逐年升高〔2-4〕,我国也不例外〔5-6〕。与 β-内酰胺类抗生素不同,大环内酯类抗生素不易引起过敏反应,因而在临床上使用日趋增加,导致大环内酯类抗生素耐药性肺炎链球菌株普遍流行且具有明显的地区差异〔2,5〕。有文献报道,肺炎链球对大环内酯类抗生素的耐药机制主要涉及ermB和mef E基因〔7-8〕。因此,调查我国不同地区大环内酯类抗生素耐药性肺炎链球菌流行状况及其ermB和mefE基因相关耐药机制具有重要意义。

本研究中,我们收集了浙江省各个地区临床分离的138株肺炎链球菌,采用药物敏感试验检测了上述菌株对9种临床常用抗生素的耐药性,采用PCR检测了上述菌株中ermB和mef A基因分布,以初步了解本地区大环内酯类抗生素耐药性肺炎链球菌的流行情况及其主要耐药模式。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 138株肺炎链球菌临床菌株分离自2006年至2009年浙江省不同地区病人临床标本并经系统的细菌学鉴定。药敏试验质控菌株肺炎链球菌ATCC49619购自卫生部临检中心,金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922和大肠埃希菌DH5α株由浙江大学医学院病原生物学系提供。肺炎链球菌接种于含5%脱纤维羊血的MH琼脂平板上,37℃、5%CO2条件下培养;金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌接种于MH琼脂平板上37℃培养。

1.1.2 主要试剂 各抗生素E-test条或纸片分别购自瑞典AB-BioDisk公司及杭州天和微生物制剂有限公司。MH琼脂购自英国Oxoid公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海博彩生物科技有限公司(BioColor)。PCR试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和T-A克隆试剂盒购自大连宝生物有限公司(TaKaRa)。

1.2 方法

1.2.1 细菌基因组DNA模板制备 将新鲜细菌培养物3 000 r/min离心,取沉淀的菌体用0.01mol/L、pH7.4的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤、离心3次后取沉淀。参照细菌基因组DNA提取试剂盒(BioColor)说明书,提取各菌株基因组DNA。提取的DNA溶于T ris-HCl-EDTA(TE)缓冲液中,采用紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度〔9〕。

1.2.2 PCR 参考GenBank中登录的ermB基因(accession No.:AJ243540)和 mefE基因(accession No.:AF274302)序列及相关文献设计引物〔10-11〕。扩增ermB 基因片段(1114～ 1851 bp)引物序列:上游5'-GAA AAA GTA CTC AAC CAA ATA-3',下游 5'-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GT T-3'。扩增mefE基因片段(1741～2006 bp)引物序列:上游5'-agg gag atg aaa gaa gga-3',下游5'-ATA AAA TGG CAC CGA AAG CCC-3'。引物由上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)合成。PCR总体积为100μL,内含2.5 mol/L各 dNTP、250 nmol/L各引物、2.5 U Taq-Pfu酶(TaKaRa)、100 ng DNA模板和 1×PCR缓冲液(pH8.3)。PCR参数:94℃5 min;94℃30s、54℃30s、72℃45s(mefE基因片段)或60s(ermB基因片段),35个循环;72℃7 min。采用溴乙锭预染的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,ermB和mef E基因片段目的扩增片段预期大小分别为639 bp和366 bp。

1.2.3 目的扩增产物克隆和测序 为了核实PCR扩增产物的特异性,采用PCR产物纯化试剂盒(TaKaRa)提取部分阳性目的扩增片段。按T-A克隆试剂盒(TaKaRa)说明书,将提取ermB和mef E基因片段扩增产物克隆入pMD18-T载体中,形成重组质粒 pMD18-TermB和 pMD18-TmefE,转化入 E.coli DH5α中扩增后,采用小量碱变性法提取重组质粒〔9〕,委托上海Invitrogen公司测序。

1.2.4 药敏试验 采用K-B纸片法和E-test检测138肺炎链球菌临床菌株对9种抗生素的敏感性。E-test法严格按照产品说明书进行操作和判读结果,K-B纸片法参照NCCLS标准判读结果〔12〕。实验中分别采用肺炎链球菌ATCC49619、金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希菌ATCC25922株进行质量控制。

1.3 统计学分析 采用SSPS 11.0统计软件,对ermB和mef E基因检测阳性率及耐药率进行χ2检验,P＜0.05认为有统计学差异。

2 结 果

2.1 ermB和mef E基因PCR检测结果 肺炎链球菌临床菌株的ermB和mef E基因PCR检测效果见图1和图2。138株肺炎链球菌菌株中,91.3%(126/138)检出ermB基因,33.3%(46/138)检出mef E基因,其中38株ermB和mef E基因检测结果均阳性,ermB基因携带率(91.3%)明显高于mef E基因(33.3%)(P＜0.05)。

2.2 ermB和mef E基因PCR产物测序结果 9株肺炎链球菌临床菌株ermB和mefE基因片段PCR产物测序结果见图3和图4。与GenBank中ermB基因(accession No.:AJ243540)和mef E基因(accession No.:AF274302)序列比较,除引物序列外上述肺炎链球菌临床菌株ermB和mef E基因片段核苷酸序列相似性分别为99.16%～100%和99.08%～100%。

2.3 药敏试验结果 138株肺炎链球菌临床菌株中,对红霉素耐药率高达93.5%(129/138),对青霉素、喹奴普达/达福普汀的氯霉素和耐药率为18.8%～42.0%,但对头孢噻肟、头孢呋辛、阿莫西林和左氧氟沙星的耐药率较低(2.9%～4.3%),未发现耐万古霉素菌株(表1)。

2.4 ermB和mef E基因与红霉素耐药性关系138株肺炎链球菌临床菌株中,无ermB及mef E基因的所有4株菌株、2株仅含ermB基因和2株仅含mef E基因菌株对红霉素敏感,其余菌株均对红霉素耐药(表2)。

3 讨 论

青霉素是治疗革兰阳性肺炎链球菌感染性疾病的首选药物。由于青霉素可导致严重的药物过敏反应,作为大环内酯类代表性抗生素的红霉素,被广泛用于肺炎链球菌感染相关疾病。随着青霉素和红霉素的广泛应用,临床上相关耐药肺炎链球菌菌株的分离率逐年升高〔2-6〕。在亚洲地区,肺炎链球菌临床菌株对红霉素耐药现象尤其严重〔4〕,我国重庆、上海和青岛等地近年报道的肺炎链球菌对红霉素耐药率高达96.0%～100%〔5-6〕。本研究中,浙江地区分离的138株肺炎链球菌临床菌株对红霉素耐药率也高达93.5%(129/138),但对青霉素耐药率也为18.8%,对阿莫西林、头孢噻肟和头孢呋辛耐药率分别仅为2.9%、2.9%和4.3%,提示红霉素已不适合作为肺炎链球菌感染性疾病的临床药物,β-内酰胺类及头孢菌素类可作为临床上治疗肺炎链球菌感染性疾病的一线药物。

表1 138株肺炎链球菌临床菌株对10种抗菌药物的耐药率Table 1 Drug resistant ratios against 10 antibacterial drugs of 138 S.pneumoniae isolates

表2 ermB和mefE基因与红霉素耐药相关性Table 2 Correlation among ermB/mef E genes and erythromycin/clindamycin

肺炎链球菌ermB基因编码红霉素耐药相关核糖体甲基化酶,该基因通常定位在细菌染色体上,其转座也通常发生在染色体与染色体之间,在核糖体甲基化酶作用下,细菌23 SrRNA第25位腺嘌呤残基N-6位甲基化,降低了细菌核糖体与红霉素的结合力,可介导细菌对所有大环内酯类的高水平耐药〔10〕。肺炎链球菌mef E基因是细菌主动外排基因操纵子元件,编码一种能量依赖的膜药物外排泵蛋白,可将14、15元环红霉素等大环内酯类抗生素泵出细菌细胞外,使细菌产生低水平耐药性〔10-11〕。为了解本地区肺炎链球菌临床菌株ermB和mef E基因携带率,我们采用PCR对上述菌株两种目的基因进行了检测,测序结果表明,扩增产物确为ermB或mef E基因,99.08%～100%序列相似性提示该两个基因序列极为保守。PCR结果显示,138株肺炎链球菌临床菌株中,ermB基因携带率很高(91.3%),mef E基因携带率较低(33.3%),27.5%菌株(38/138)同时携带上述两种基因,表明ermB基因是本地区肺炎链球菌临床菌株红霉素耐药相关优势基因(P＜0.05)。

肺炎链球菌对红霉素耐药机制在不同国家和地区颇有差异。在欧洲和亚洲,肺炎链球菌对红霉素耐药性主要由ermB基因表达产物介导〔5-6,13-15〕;在美国和加拿大,携带mef E基因的肺炎链球菌菌株对红霉素耐药更为常见〔7-8〕。本研究中138株肺炎链球菌临床菌株ermB和mef E基因携带状态与红霉素耐药相关性分析结果显示,不携带上述两种基因菌株均对红霉素敏感,仅携带mef E基因菌株对红霉素耐药率(62.5%)明显低于同时携带两种基因菌株耐药率(100%)及仅携带ermB基因菌株耐药率(97.7%)(P＜0.05),提示ermB和mef E基因不仅确与肺炎链球菌红霉素耐药密切相关,且ermB基因可使细菌产生较mef E基因更强的红霉素耐药性。

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