猪带绦虫乳酸脱氢酶基因的序列分析、克隆表达和免疫学分析*

杜武英,黄 江,胡旭初,余新柄,徐 劲 ,廖兴江,戴佳琳

猪带绦虫为世界性分布,成虫寄生于人体肠道引起猪带绦虫病,幼虫寄生于人体皮下、肌肉或内脏引起囊尾蚴病〔1〕。在我国,猪带绦虫病与囊虫病分布及流行态势多呈片状分布,且青壮年发病率较高,少数地方近年来儿童囊虫病有上升趋势。本课题组近年来从猪带绦虫基因组及蛋白质组学的研究入手,系统地开展猪带绦虫基因的鉴定和功能研究。我们从猪带绦虫成虫全长cDNA文库中克隆了一个乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)的同源基因,力图通过对该基因及其编码的蛋白结构和特征进行全面的生物信息学分析,以指导该基因的克隆表达、重组蛋白的纯化及免疫学特性的初步研究,从而为其生物学功能研究及其在诊断、药物及疫苗方面的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 猪带绦虫成虫虫体标本 采自四川甘孜州雅江县,猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库由北京华大基因研究中心构建,大规模测序得到多个表达序列标签(expressed sequence tag,EST)、利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站的基本局部比对搜索工具(basic local aligment search tool,Blastx,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)归并EST获得Unique Gene(Unigene)由本课题组与上海英骏生物公司合作完成。编码猪带绦虫成虫LDH基因文库质粒编号为0_001458。

1.1.2 质粒,菌株 原核表达质粒pET-28a(+)和大肠杆菌BL-21/DE3由中山大学医学院病原生物学实验室保存。

1.1.3 感染猪带绦虫猪血清 由贵阳医学院寄生虫学教研室提供,病人血清采自猪带绦虫流行区。

1.1.4 主要试剂和工具酶 NcoⅠ,XhoⅠ,T4 DNA连接酶,DNA标准(DL2000)均购自自TaKa-Ra公司;Ex Taq酶(含 dNTP)和异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG),购自美国Promega公司;Ni-IDA Agarose(cat No:69670)购自美国Novagen公司;蛋白分子量标准购自立陶宛MBI公司;DNA凝胶回收试剂盒,质粒纯化试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司;辣根过氧化物酶标记的数种二抗和DAB(3,3二氨基联苯胺)显色试剂盒均购自武汉博士德有限公司;PVDF膜购自Millipore公司;TMB显色试剂盒购自美国BD公司;SDS等试剂均购自上海申友生物科技公司。

1.1.5 引物合成和DNA测序 基因扩增引物和重组质粒DNA测序由Introvigen上海生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Ts LDH-A基因的识别及其推导氨基酸序列的生物信息学分析 通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站的基本局部比对搜索工具(basic local aligment search tool,BlastX,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)程序,将文库质粒编号为0_001458的插入序列与GenBank中的序列进行比对分析;利用Vector NTI suite软件包推导基因的开放阅读框和氨基酸序列;利用通过瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(Expert Protein Analysis System,ExPASy,http://ca.expasy.org/)、IEDB Analysis Recource(http://tools.immuneepitope.org/main/jsp/menu.Jsp)提供的分析工具分别预测分析蛋白质的理化性质、一级、二级结构等,以及利用 3D-PSSM对蛋白质的空间构象建模。

1.2.2 Ts LDH-A基因的的克隆表达 Ts LDHA基因的扩增:根据已获得的Ts LDH-A编码序列,利用DNAClub和PCRdesign设计引物:

以猪带绦虫成虫cDNA文库中Ts LDH-A基因的克隆质粒为模板,通过 PCR扩增,回收扩增产物。

重组原核表达质粒(pET-28a(+)-Ts LDH-A)的构建及鉴定:将PCR产物和原核表达质粒pET-28a(+)经 Nco I和Xho I双酶切后回收、连接,转化入大肠杆菌BL-21/DE3感受态细胞,卡那霉素筛选阳性克隆。对阳性克隆提取质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。

Ts LDH-A基因在大肠杆菌BL-21/DE3中以IPTG诱导表达后,离心收集菌体,制备成电泳样品并进行SDS-PAGE电泳分析。

Ts LDH-A基因在大肠杆菌BL-21/DE3中的大量诱导表达和纯化:对阳性克隆进行大量诱导表达,离心收集菌体、超声裂解后离心收集上清并过滤,参照Ni-IDA Agarose说明书进行蛋白纯化,收集蛋白洗脱液,SDS-PAGE电泳分析目的蛋白。将洗脱的目的蛋白在0.15mol/L的PBS(pH7.9)透析液中4℃透析24h。透析后的蛋白-80℃冻存备用。

1.2.3 动物免疫实验 用纯化的重组蛋白以腹部皮下多点注射方式免疫SD大鼠,共免疫3次,于末次免疫后2周剪尾采血,分离血清。

1.2.4 Western Blotting检测重组蛋白的免疫学特性 将纯化的蛋白进行SDS-PAGE(12%)电泳,使用电转移仪于100V冰浴转印1h,将蛋白转移至PVDF膜上。一抗分别为重组蛋白免疫的SD大鼠血清、感染猪带绦虫的猪血清、感染猪带绦虫病人血清、亚洲带绦虫病人血清和感染牛带绦虫病人血清(1∶100稀释),二抗相应为辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠IgG、山羊抗猪IgG和兔抗人IgG(1∶2 000稀释)。DAB显色至出现目的条带,超纯水终止反应。

2 结 果

2.1 Ts LDH-A的生物信息学分析结果

2.1.1 编号为0_001458文库质粒的插入序列的Blastx分析 从BLASTX的分析结果来看,该基因是乳酸脱氢酶A的同源基因,与GenBank中其他物种同源基因的氨基酸序列的一致性为54%左右。从比对结果来看,该克隆基因的5′端序列长于其他物种完整的乳酸脱氢酶编码序列,该基因应该是猪带绦虫A型乳酸脱氢酶的全长基因序列,其最大的ORF就是其完整的编码区。Rpsblast分析发现其有乳酸脱氢酶的保守结构域。

2.1.2 Ts LDH-A蛋白质的理化性质、翻译后的修饰位点及亚细胞定位ExPASy中ProtParam预测Ts LDH-A的理论分子量和等电点分别是35 461.1 Da和7.09。含有9个半胱氨酸,彼此之间形成二硫键可能性小。在溶液中的不稳定指数为25.56,低于域值40,蛋白性质较稳定;脂肪族指数105.05,总亲水性0.239。PROSCAN分析特定位点结果显示:Ts LDHA含有5个潜在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点;有3个潜在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点,有1个酪氨酸激酶(PTK)磷酸化位点;7个潜在的N-肉豆蔻酰位点;有1个L-乳酸脱氢酶活性位点,位于189-195位氨基酸。TargetP预测 Ts LDH-A无信号肽序列,无线粒体、过氧化酶体、溶酶体和细胞核等定位序列。

2.1.3 Ts LDH-A一级结构中包含的结构和功能域特征序列 ExPASy中InterPro Scan扫描结果显示该氨基酸序列中含有2段乳酸脱氢酶保守功能域,分别位于N端和C端;在189aa-195aa具有酶的活性位点。

2.1.4 Ts LDH-A的拓扑结构和二级结构 Ex-PASy中PredictProtein分析蛋白的拓扑结构和二级结构,该蛋白有三个跨膜区(图1),蛋白所含的9个半胱氨酸之间都未形成二硫键。Sec预测α螺旋(H)、β折叠(E)和无规卷曲(L)的比例分别是36.25∶22.05∶41.69。

图1 Ts LDH-A的拓扑结构、二级结构图Fig.1 The topology,secondary structure of Ts LDH-A by Predictprotein

2.1.5 Ts LDH-A的抗原表位分析 IEDB Analysis Resource中B Cell Epitope Prediction Tools分析预测Ts LDH-A的B细胞抗原表位结果显示,该氨基酸序列中有4个主要的表位:13aa-20aa(GSRHGHEP),190aa-199aa(GEHGDSSVPV),215aa-228aa(PKIGQAGDPDDFAS),307-314aa(FSPSEKQS)。

2.1.6 Ts LDH-A的三维结构及线性表位和活性位点的位置 ExPASy中3D-pssm(Phyre Version 0.2)将Ts LDH-A与蛋白结构数据库中的蛋白质三维结构进行匹配,通过二级结构比对和折叠,模建Ts LDH-A的三维结构图。图中4个黄色区段代表B Cell Epitope Prediction Tools预测的4个主要B细胞抗原表位,其中表位 190aa-199aa(GEHGDSSVPV)中包括LDH活性位点组氨酸(His192,H)。结合其它同源基因的相关实验研究〔2-4〕,将另两个LDH活性中心氨基酸精氨酸(Arg105,R)和天冬氨酸(Asp165,D)也标注其上。3个关键氨基酸在二级结构上相距甚远,但在空间结构中相互靠近,构成酶的活性中心(图2)。

图2 Ts LDH-A的3D结构、潜在抗原表位和关键氨基酸的空间位置Fig.2 The 3D structure of Ts LDH-A and the spacial localization of four possible epitopes and key aminoacids

2.2 Ts LDH-A基因的的克隆表达

2.2.1 原核重组质粒的鉴定 将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。图3中第2泳道是PCR产物,第3泳道是双酶切鉴定结果,在1000bp左右有一清晰的条带,与目的基因的大小基本相符,证明重组质粒构建成功。

图3 pET28a(+)-Ts LDH-A重组质粒的双酶切鉴定(1.0%琼脂糖凝胶电泳)Fig.3 Identification of pET28 a(+)-Ts LDH-A by with enzymes digestion

2.2.2 蛋白表达纯化结果 将构建好的重组质粒转化到E.coli BL-21/DE3中表达,SDS-PAGE电泳分析结果如图 4中第 4、5、6泳道所示,大约在36kD左右处出现表达条带,与目的蛋白分子量基本相符,说明蛋白既有可溶性表达,也有包涵体表达。纯化后蛋白位于图中第7泳道,其位置与目的蛋白相符,证明目的蛋白纯化成功。测得纯化产物的蛋白浓度为0.7mg/mL。

图4 pET28a(+)-TsLDH-A原核表达及纯化产物的12%SDS-PAGE分析Fig.4 12%SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression and purification products of pET28a(+)-TsLDH-A

2.2.3 Western Blotting鉴定 Ts LDH-A重组蛋白 将纯化好的重组蛋白分别与重组蛋白免疫的SD大鼠的抗血清、感染猪带绦虫的病人血清及感染猪带绦虫的猪血清相互作用后,结果如图5所示,在36kDa左右均可见一明显的免疫反应条带(1、3、5泳道),大小与重组蛋白预测的分子量相近,而阴性对照血清在相应的位置均未识别出该条带。

3 讨 论

多数体内寄生虫的能量主要源于无氧糖酵解,而乳酸脱氢酶(LDH)是糖酵解途径的末端酶,在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的辅助下,催化丙酮酸还原为乳酸及乳酸氧化为丙酮酸的可逆反应,被认为是影响寄生虫能量代谢重要的酶类之一〔5〕。

LDH是一同功酶家族,动物和人的LDH是以4个亚单位组成的四聚体寡聚酶的形式发挥作用的,其中由A、B两个亚基组成的同功酶具有明显的种属特异性和组织特异性并与其生化表现型和生理功能相适应〔6-9〕,近年的研究还表明LDH的表达还可能与细胞周期等有关〔10-12〕。因此对LDH同工酶基因的研究不仅可以区别物种间的遗传差别和进化特征,而且可为动物或寄生虫个体发育过程中基因表达和调控研究提供良好的模式。既往对于蠕虫LDH的研究较少。血吸虫和华支睾吸虫 LDH分子结构与功能的研究提示LDH既是一个有潜力的诊断和疫苗候选抗原,又是吡喹酮、蒿甲醚等重要的抗寄生虫药物作用靶点之一,也是研究生物种系进化较好的指标分子〔2-3,13-16〕。本课题组近年来对亚洲带绦虫成虫LDH基因的研究结果也提示,Ta LDH基因是一有潜力的疫苗候选抗原或药物作用靶标〔4,17〕。以上相关理论及实验结果表明,研究比较三种人体带绦虫(猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫)的乳酸脱氢酶及其同工酶家族成员的结构与功能具有重要的理论意义和应用价值。

图5 pET28a(+)-TsLDH-A重组蛋白的 Western blotting分析Fig.5 Westen blotting analysis of the pET28a(+)-TsLDHA recombinant

本研究首先从课题组构建的猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出编号为0_001458文库质粒,经NCBI网站Blastx在线分析,该质粒的插入序列编码的氨基酸序列与GenBank中其它物种的A型乳酸脱氢酶同源性可达到54%左右,并具有完整的乳酸脱氢酶保守功能域,推测该质粒插入序列为猪带绦虫乳酸脱氢酶A的编码序列,该序列含有完整的开放阅读框,是一个全长cDNA序列。预测其编码的蛋白相对分子量理论值是35 461.1Da,理论等电点为7.09,蛋白的理化性质较稳定。

其次,根据以上分析的理论结果,本研究应用原核表达载体 pET28a(+)对 Ts LDH-A进行亚克隆,转化入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET28a(+)-T s LDH-A构建成功。将融合表达和纯化的产物行SDS-PAGE电泳分析,结果显示目的条带分子量与预测值基本一致,表明重组蛋白得到了表达并且纯化成功。Western Blotting结果表明纯化蛋白能被重组蛋白免疫的SD大鼠血清、感染猪带绦虫的病人血清和猪血清识别,说明重组蛋白在纯化后具有较好的免疫原性和免疫反应性,提示Ts LDHA可能是一潜在诊断抗原。

再次,生物信息学分析预测还提示Ts LDH-A有3个跨膜区,没有线粒体、过氧化酶体、溶酶体和细胞核等亚细胞定位序列。结合LDH在其它绦虫的组织定位和特性,如韩国学者发现曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni,Sm)LDH在成虫及裂头蚴的皮层及皮下肌层活性最高〔18〕、本课题组的免疫组织化学结果显示亚洲带绦虫LDH重组蛋白定位于成虫的表膜和虫卵的胚膜〔17〕,我们推测 Ts LDHA可能在猪带绦虫成虫的表膜上分布较多,而分布在表膜的蛋白则有可能为药物的靶分子,或是诊断抗原的候选分子。拓扑学分析发现酶催化中心的组氨酸残基(His192)位于潜在的 B细胞抗原表位序列190aa-199aa(GEHGDSSVPV)中,由于 His192是酶活性中心的关键氨基酸,特异性抗体如与之结合,His192就不能正常行使其在酶促反应中的功能,从而会影响整个酶的活性,在宏观上可表现为酶促反应受到抑制。由此又可以推断Ts LDHA特异性抗体可能结合虫体表膜上 LDH的抗原表位,这种结合可能会抑制酶的活性、影响到虫体的糖代谢,因而从这一角度分析 Ts LDH-A也可能是一个重要的药物靶标。同时,Ts LDHA分子暴露在虫体表膜上使它可能成为免疫攻击的靶点,介导补体的杀伤作用、抗体的ADCC作用和细胞免疫攻击,因此Ts LDH-A还可能是一个疫苗侯选分子。

比较已有的寄生虫 LDH的研究进展,综合本研究的生物信息学预测理论、实验结果及合理的分析推测可知,对猪带绦虫A型乳酸脱氢酶基因的克隆、表达及可溶性重组蛋白的纯化,能够为进一步研究该基因的生物学功能以及在诊断、疫苗研究方面的作用奠定基础,可以为区别物种间的遗传差别和进化特征提供线索,甚至有可能在三种人体带绦虫个体发育过程中基因表达、调控的研究和分类关系方面给我们一定的启示。

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