苯酚降解菌的固定化及其降解特性的研究

薛 锋，高 健

(盐城工学院化学与生物工程学院，江苏 盐城 224051)

含酚废水是一种难降解有机废水，严重污染环境[1]。目前常用微生物处理含酚废水，但广泛采用的活性污泥法存在着微生物浓度低、菌体流失的缺点。固定化技术是将分散、游离的微生物通过某种物理或化学的方法集中起来，固定在某一限定区域以提高微生物的活性，有利于提高污染物的处理负荷和去除效率[2，3]。将固定化技术应用到废水生物处理过程中，可以克服菌体流失的缺点，且固定化细胞降解污染物的效率较游离细胞有很大提高[4～6]。

作者在此以海藻酸钠为载体，对苯酚降解菌产碱菌(Alcaligenessp.)YC-F81进行包埋，通过单因素实验确定了较优的包埋条件，并对固定化苯酚降解菌的降解性能进行了初步研究。

1 实验

1.1 菌株、试剂与培养基

高效苯酚降解菌产碱菌(Alcaligenessp.)YC-F81，自行分离得到。

苯酚，海藻酸钠，CaCl2。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，苯酚0.3 g，蒸馏水1 L，pH值自然。

苯酚无机培养基：MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO40.5 g，K2HPO40.5 g，CaCl20.1 g，NaCl 0.2 g，NH4NO30.1 g，蒸馏水1 L，苯酚按需加入。

固体培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入20 g琼脂。

1.2 方法

1.2.1 细菌的培养

将菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃的恒温培养箱中活化72 h，然后从驯化的菌落中挑取适合的菌落接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃、150 r·min-1摇床培养24 h。将菌悬液接种至新鲜的牛肉膏蛋白胨液体培养基，在相同的条件下培养12 h，得到对数生长期的菌体。

1.2.2 海藻酸钠包埋

将对数生长期的菌悬液低速离心(5000 r·min-1、15 min)后，倒去上清液，称取适量湿菌体与一定质量浓度的海藻酸钠溶液充分搅拌混合均匀，用恒流泵自动流入到一定质量浓度的CaCl2溶液中，于4℃冰箱放置12 h，得到直径均匀的固定化细胞颗粒。用无菌水冲洗后即可使用。

1.3 苯酚含量的测定

采用4-氨基安替吡啉直接光度法[7]。将培养液于5000 r·min-1离心10 min，取上清液100 μL加入到10 mL的试管中，加蒸馏水至5 mL；加入100 μL 0.5 mol·L-1的氨水溶液，用pH值6.8的磷酸缓冲溶液调pH值至7.9左右；加50 μL 2%的4-氨基安替吡啉，混匀；再加50 μL 8%的铁氰化钾溶液，混匀，15 min后，测定510 nm处吸光度。

2 结果与讨论

2.1 固定化细胞的形态(图1)

图1 固定化细胞形态

由图1可以看出，苯酚降解菌用海藻酸钠固定化后，为白色不透明小球，直径5 mm左右，有一定的强度和弹性。

2.2 固定化条件的研究

2.2.1 海藻酸钠质量浓度对苯酚降解率的影响

海藻酸钠是一类天然高分子多糖，对微生物没有毒害作用，但海藻酸钠的浓度会影响固定化细胞的机械强度、质量传递等，进而影响微生物的活性。用不同质量浓度的海藻酸钠为载体制备固定化细胞颗粒，进行苯酚降解实验，结果见图2。

图2 海藻酸钠质量浓度对固定化细胞降解苯酚的影响

由图2可以看出，随着海藻酸钠质量浓度的增大，固定化细胞的苯酚降解率有所上升；当海藻酸钠质量浓度为3.0%时，机械强度和降解率都比较理想；当海藻酸钠质量浓度超过3.0%时，由于粘度增加，成球比较困难。因此，确定适宜海藻酸钠质量浓度为3.0%。

2.2.2 凝胶化剂CaCl2质量浓度对苯酚降解率的影响

分别采用不同质量浓度的CaCl2溶液作为凝胶化剂制备固定化细胞颗粒，进行苯酚降解实验，每个样平行3次，结果见图3。

图 3 CaCl2质量浓度对固定化细胞降解苯酚的影响

由图3可以看出，当CaCl2质量浓度为4.0%时，降解率达到最大；当CaCl2质量浓度过低或过高时，苯酚降解率都不理想。这是因为，低质量浓度CaCl2在使用过程中会出现膨胀、裂缝或破碎现象；而高质量浓度CaCl2虽然明显提高了固定化细胞颗粒的机械强度、减少了自由细胞，但固定化细胞颗粒的外层迅速钙化变硬，而内部钙化程度仍较低，由于外层的凝胶网格过于紧密，使得固定化细胞颗粒的弹性和扩散性能降低，对底物的利用率也有所下降，其催化性能不理想。因此，确定适宜CaCl2质量浓度为4.0%。

2.2.3 湿菌体量对苯酚降解率的影响

分别以不同量的湿菌体与10 mL质量浓度为3.0%的海藻酸钠溶液制成海藻酸钠固定化细胞颗粒，考察湿菌体量对苯酚降解率的影响，结果见图4。

图4 湿菌体量对固定化细胞降解苯酚的影响

由图4可以看出，随着湿菌体量的增加，降解率不断升高；但当湿菌体量达到0.4 g后，再增加湿菌体量，降解率升幅不明显。这是因为，在一定范围内，单位体积凝胶包埋湿菌体量越多，苯酚降解率越高；但随着细胞量的增大，固定化细胞与底物的接触量减小，也有可能是由于细胞中其它成分(蛋白质、多糖等)的增加，产生竞争性吸附，从而影响苯酚降解率。因此，确定适宜湿菌体量为0.4 g。

2.3 降解特性的研究

2.3.1 苯酚浓度对固定化细胞降解苯酚的影响

将0.4 g游离菌体与含等量菌体的固定化小球加入到含苯酚浓度(mg·L-1)分别为300、500、600、800、1000 1200、1500的50 mL无机液体培养基中，于30℃、150 r·min-1摇床培养48 h，每组3个平行，测定其苯酚降解率，结果见图5。

图5 苯酚浓度对苯酚降解率的影响

由图5可以看出，随着苯酚浓度的增加，游离细胞和固定化细胞对苯酚的降解率都有所下降，但是固定化细胞的苯酚降解率比游离细胞的高，且苯酚的耐受性强于游离细胞。这可能是因为，载体对固定在其中的微生物细胞起到了保护作用，苯酚在由固定化载体表面扩散到载体内部时，生长在载体表层的菌落形成了一层保护屏障。

2.3.2 pH值对固定化细胞降解苯酚的影响

将0.4 g游离菌体与含等量菌体的固定化小球加入到pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的含600 mg·L-1苯酚的50 mL无机液体培养基中，于30℃、150 r·min-1摇床培养48 h，测定其苯酚降解率，结果见图6。

图6 pH值对苯酚降解率的影响

由图6可以看出，固定化细胞与游离细胞降解苯酚的最佳pH值均为6.0～8.0。当pH<6.0或者pH>8.0时，苯酚降解率比较低；在相同pH值下，固定化细胞的苯酚降解率高于游离细胞。这可能是因为，海藻酸钠对包埋在其中的菌体有一定的保护作用，减轻了环境对菌体的伤害。因此，确定最适pH值为7.0。

2.3.3 温度对固定化细胞降解苯酚的影响

将0.4 g游离菌体与含等量菌体的固定化小球加入到pH值7.0的含600 mg·L-1苯酚的50 mL无机液体培养基中，分别在不同温度、150 r·min-1摇床培养48 h，测定其苯酚降解率，结果见图7。

图7 温度对苯酚降解率的影响

由图7可以看出，30℃时，苯酚降解率达到最大；且在相同温度下，固定化细胞的降解率比游离细胞高。因此，确定最适温度为30℃。

2.3.4 NaCl质量浓度对固定化细胞降解苯酚的影响

将0.4 g游离菌体与含等量菌体的固定化小球加入到pH值7.0的含600 mg·L-1苯酚的50 mL无机液体培养基(其中NaCl质量浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%)中，于30℃、150 r·min-1摇床培养48 h，测定其苯酚降解率，结果见图8。

图 8 NaCl质量浓度对苯酚降解率的影响

由图8可以看出，固定化细胞对NaCl的耐受性高于游离细胞。NaCl质量浓度超过2.0%后，游离细胞的苯酚降解率很低；而固定化细胞在NaCl质量浓度为2.5%时的苯酚降解率仍有80%左右，其后才明显下降。这可能是因为，钠离子是细胞运输系统的组分，其主要作用是维持渗透压及某些酶的稳定性，当培养基中盐含量过高时就有可能破坏细胞的运输系统或造成某些酶类的失活，影响它们对营养物质的吸收利用和降解，表现为苯酚降解率的下降；细胞固定化后，由于有了载体的保护，固定化细胞周围的NaCl浓度要远低于培养基中NaCl的浓度，因而对细胞的运输系统和酶的伤害较小。因此，NaCl质量浓度应低于2.5%。

3 结论

以海藻酸钠为载体，将驯化的苯酚降解菌进行了固定化，确定了较佳的固定化条件为：海藻酸钠质量浓度3.0%、CaCl2质量浓度4.0%、湿菌体量0.4 g/10 mL海藻酸钠溶液；固定化细胞降解苯酚的最适条件为：温度30℃、pH值7.0、NaCl质量浓度低于2.5%。在相同条件下，在以苯酚为唯一碳源的无机培养基中投加相同菌量的固定化细胞与游离细胞，固定化细胞的苯酚降解率与耐受苯酚能力明显高于游离细胞，800 mg·L-1苯酚降解48 h，降解率可达99%以上。

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