超滤提取黄芪多糖的工艺研究

黄芪(Radixastragali)为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，补中益气,含有多糖、甙类、氨基酸、黄酮和微量元素等多种化学成分[1]。近年来经研究及临床验证，分子量小于80 000的黄芪多糖可制成静脉注射液，用于化疗后的滋补，以提高人体的免疫力[2]，也可以对其改性而增强其活性，具有很好的抗艾滋病和抗凝血作用[3，4]；分子量大于80 000的黄芪多糖则可制成营养口服液。

按不同分子量分离提取黄芪多糖是黄芪综合利用的重要途径,其中能否分离出均一的多糖非常重要。鉴于超滤技术[5]具有设备简单、操作方便、节省能源、不产生二次污染等优点，作者在此采用超滤技术对黄芪多糖进行分离纯化，考察了操作压力、运行温度、流速、初始料液浓度等工艺参数对超滤提取的影响，拟为黄芪多糖在医药领域和保健品行业的工业化开发提供参考。

1 实验

1.1 原料、试剂与仪器

黄芪多糖，甘肃效灵生物开发有限责任公司。

葡萄糖、乙醇、苯酚、硫酸，均为分析纯。

UV-2401PC型紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂；HH-601型恒温水浴锅，金坛恒丰仪器厂；DDS-307型电导率仪；Hanna浊度分析仪；高速管式离心机；平板式超滤膜设备：膜面积1 m2，截留分子量(或孔径)0.2 μm、0.1 μm、20万、10万、5万、2万、1万、0.5万，厦门世达膜科技有限公司。

1.2 装置(图1)

1.料液箱 2.低压泵 3.保安过滤器 4.高压泵 5.膜组件 6.透过液流量计 7.调压阀 8.浓缩液流量计 9.换热器

黄芪多糖水提液由料液箱流入低压泵，通过保安过滤器后，由高压泵输入到膜组件中，经膜组件分离后，透过液通过膜组件上的透过液出口经透过液流量计流出待用；浓缩液经膜组件浓缩液出口经过调压阀、浓缩液流量计和换热器后循环至料液箱。根据不同的实验目的，选择循环或浓缩过程。用调节阀调节压力。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖14 mg，置100 mL量瓶中，加适量水溶解，稀释至刻度，摇匀，即得0.14 mg·mL-1对照品溶液。分别精密量取对照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL置具塞试管中，加水至2 mL;再精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀；迅速精密加入硫酸6 mL，摇匀，置40℃水浴10 min，取出；置冰水浴5 min，取出。以相应的试剂为空白，在490 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

拟合葡萄糖标准曲线得到线性回归方程y=61.29x+0.0015，相关系数为0.9981。式中：y为吸光度；x为葡萄糖浓度(mg·mL-1)。

1.3.2 样品测试

精密吸取待测样品2 mL，按1.3.1方法测定吸光度，根据回归方程计算多糖含量。

1.3.3 分析方法

式中：ci为膜组件进料中多糖浓度；cp为透过液中多糖浓度。

电导率采用DDS-307型电导率仪测定，浊度采用Hanna浊度分析仪测定。

2 结果与讨论

2.1 预处理

为了降低超滤对膜的污染、保证超滤膜的分离特性和通量、克服浓差极化，浸提液必须在超滤前进行预处理，除去不溶性固形物。以固形物去除率及多糖损失为指标对离心(3000 r·min-1)5 min、0.8 μm微滤以及5 μm精密过滤3种预处理方法进行比较，结果见表1。

表1 3种预处理方法比较

由表1可见，3种预处理方法均可有效地去除粗多糖溶液中的杂质。微滤预处理时，多糖损失高达66.0%，这可能是一些大分子量(大于200万)[6，7]的黄芪多糖被微滤膜截留的缘故；5 μm精密过滤多糖损失最小，但不溶性固形物去除率稍差；高速离心对不溶性固形物有较高的去除率，多糖损失也较少。

预处理方式的选择与后续超滤膜的选择密不可分，若要最大限度保留所有多糖，则选择精密过滤进行预处理，同时，超滤选择板式或管式；若要收集所要求的截留分子量的部分多糖，则选择高速离心进行预处理，同时，超滤选择卷式或中空纤维。预处理方式的选择较为灵活，应根据料液性质、富集多糖的范围来定。

2.2 黄芪多糖分子量的分布

在35℃、0.3 MPa条件下选用截留分子量分别为400 kDa、200 kDa、10 kDa的滤膜对黄芪提取液依次进行超滤，将多糖提取液分为4段，测定每段的多糖含量，结果见图2。

图2 黄芪多糖的分子量分布

由图2可知，超滤后分子量>400 kDa的黄芪多糖约占总糖的40.6%，分子量在400～200 kDa之间的黄芪多糖占10.1%，分子量在200～10 kDa之间的黄芪多糖占33.5%，分子量<10 kDa的寡糖和单糖约占15.2%。

多糖的药理活性与其初级结构、高级结构、分子量、溶解度、粘度有着密切的关系，多糖分子的多级结构又与其分子量有着直接的关系，一般分子量为100～200 kDa的高分子多糖呈现较强的活性[8～10]，分子量为10～100 kDa的黄芪多糖具有免疫调节作用[11～13]。因此，选择分子量为10～200 kDa的黄芪多糖作为活性黄芪多糖制品进行后续实验。

2.3 超滤工艺的优化[14]

2.3.1 温度对超滤的影响

唐亮（化名）自认为是网络游戏高手，但是自从在虚拟世界中遭遇另外一位游戏玩家“古世龙”后，就遭遇到了游戏的“滑铁卢”。“古世龙”在网络中杀死了唐亮的朋友，抢了唐亮在游戏中的老婆，两人在游戏中多次厮杀，唐亮总是失败。终于，在网络游戏中被杀死23次之后，分不清虚拟世界和真实世界的唐亮，决定采取一种特殊的报复方式，一场网络游戏引起的血案就此发生。他叫上几个平时一起玩网络游戏的兄弟，找到现实当中的“古世龙”，教训了他一顿。一场虚拟世界里的厮杀终于演变成了一场现实当中的厮杀，二者最大的区别就是，在真实的世界里，人的生命只有一次。

在0.3 MPa压力下，用截留分子量为10 kDa的滤膜对黄芪提取液进行超滤，温度对膜通量的影响如图3所示。

图3 温度对膜通量的影响

由图3可知，随着温度的升高，膜通量增大。这是因为在一定范围内，升高温度使溶液粘度下降、扩散系数和传质系数增大、多糖溶解度增大，溶质与水的亲合力相应增大，浓差极化相应减小，导致膜通量增大；但温度过高会导致滤膜性能和溶液理化性质的改变。综合考虑，选择超滤温度为30℃。

2.3.2 压力对超滤的影响

在 30℃对黄芪多糖提取液进行超滤，压力对膜通量的影响如图4所示。

图4 压力对膜通量的影响

由图4可知，随着压力的增大，膜通量显著增大。这是因为压力差较小时，压力的增大使溶液通过滤膜的推动力增大，故膜通量明显增大。当压力达到 0.35 MPa 后，膜通量趋于恒定；如再增加压力，膜通量增加使得膜面上被截留溶质的浓度增大，浓差极化作用加剧，开始形成较厚的膜面凝胶层，导致阻力大大增加，因而膜通量增加较少。综合考虑，选择超滤压力为0.35 MPa。

2.3.3 流速对超滤的影响

在30℃、0.35 MPa条件下对黄芪多糖提取液进行超滤，进料流速对膜通量的影响见图5。

图5 流速对膜通量的影响

由图5可知，随着流速的不断加快，膜通量呈上升趋势。这是因为加快流速阻碍了浓差极化的积累和形成，并且对膜面的沉积物也具有冲刷作用，从而减缓了膜面的污染。当流速超过0.467 L·s-1时，膜通量反而下降。这是因为流速加快并不能从根本上消除膜污染，过快的膜表面流速反而增大了压力损失，作用在膜表面的有效压力减小，膜通量也随之减小。因此，选择进料流速为0.467 L·s-1。

2.3.4 初始料液浓度对超滤的影响

在30℃、0.35 MPa、0.467 L·s-1条件下，对黄芪多糖提取液进行超滤，初始料液浓度对膜通量的影响见图6。

图6 初始料液浓度对膜通量的影响

由图6可知，膜通量随着初始料液浓度的增大而减小。这是因为，一方面随着初始料液浓度的增大，料液粘度增大，溶质扩散系数减小，由膜边界向料液主体的反向扩散通量减小，浓差极化严重；另一方面初始料液浓度增大，溶质沉积在膜表面，阻塞膜孔，增加扩散阻力，造成通量下降。由于初始料液浓度太低会增加浓缩的费用，综合考虑，选择初始料液浓度为20 g·L-1。

2.4 黄芪多糖超滤产物

黄芪粗多糖水溶液采用5 μm精密过滤进行预处理，处理液在初始料液浓度为20 g·L-1、温度为30℃、压力为0.35 MPa及进料流速为0.467 L·s-1的条件下，用截留分子量为200 kDa和10 kDa的滤膜依次对料液进行超滤，取分子量为100～200 kDa之间的浓缩液，进行超滤得到活性黄芪多糖制品。制品中多糖含量由原来的36.0%提高到86.8%，说明超滤是一种很有效的多糖纯化方法。

2.5 超滤膜的清洗

在35℃、0.3 MPa下分别采用去离子水、氢氧化钠溶液对污染后的超滤膜(以10 kDa为例)进行清洗，结果见表2。

表2 超滤膜的清洗效果对比

由表2可知，超滤膜经去离子水清洗后，膜通量恢复较差，只有31.5%；采用氢氧化钠溶液清洗后，膜通量恢复率达到84.7%。

3 结论

采用截留分子量为200 kDa和10 kDa的超滤膜对黄芪多糖进行提取分离，在初始料液浓度为20 g·L-1、压力为0.35 MPa、温度为35℃、进料流速为0.467 L·s-1的最佳条件下，多糖含量由36.0%提高到86.8%。有效实现了黄芪多糖提取液中活性多糖与大分子蛋白、多酚等物质的分离。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中国药典一部(2005版)[M].北京:化学工业出版社,2005:212-213.

[2] 杨金兰,武正簧.应用150-CALC/ GPC 色谱仪测试黄芪多糖的分子量及其分布[J].太原工业大学学报,1994,25(4):77-84.

[3] Soedjak H S.Colorimetric determination of carrageenans and other anionic hydrocolloids with methylene blue[J].Anal Chem，1994,66(24):4514-4518.

[4] 邓岗,耿美玉,辛现良,等.古糖酯的分光光度法测定[J].青岛海洋大学学报,1999,29(1):57-59.

[5] 郭敏亮,姜涌明.考马斯亮蓝显色液组分对蛋白质测定的影响[J].生物化学与生物物理进展,1996,23(6):558-561.

[6] 林颖,吴毓敏,吴雯,等.天然产物中糖含量测定方法正确性的研究[J].天然产物研究与开发,1996,8(3):5-8.

[7] 闫巧娟,韩鲁佳,江正强,等.黄芪多糖的分子量分布[J].食品科学,2004,25(8):27-30.

[8] Sakagami H,Aoki T,Simpson A,et al.Induction of immunopotentiation activity by a protein-bound polysaccharide，PSK(review)[J].Anticancer Research,1991,11(2):993-999.

[9] Misaki A,Kishida E,Kakuta M,et al.Carbohydrate and Carbohydrate Polymers[M].ATL Press.Mount Prospect,Illinois USA,1993:116-129.

[10] Ooi V E,Liu F.Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes[J].Current Medicinal Chemistry,2000,7(7):715-729.

[11] 方圣鼎,陈燕,徐小异,等.中药黄芪有效成分的研究(Ⅰ)多糖体的分离、性质及其生理活性[J].有机化学,1982,(1):26-31.

[12] 王莹,赵毅民,张起凤,等.黄芪中一种新葡聚糖的分离纯化与化学结构研究[J].中草药,2001,32(11):962-964.

[13] 姜东.黄芪多糖的提取、分离、纯化及其生物学活性研究[D].杭州:浙江大学,2006.

[14] 张玉忠,郑领英,高从堦.液体分离膜技术及应用[M].北京:化学工业出版社,2004:86-90.