西北地区与东北地区耳聋先证者线粒体DNA 12Sr RNA A1555G突变特点分析

鲍晓林 郭玉芬 刘晓雯 徐百成

西北地区与东北地区耳聋先证者线粒体DNA 12Sr RNA A1555G突变特点分析

鲍晓林1，2郭玉芬2刘晓雯2徐百成2

目的 分析西北地区耳聋先证者与东北地区线粒体DNA 12Sr RNA 1555位点的突变特点。方法对西北地区245例、东北地区188例耳聋先证者抽取静脉血5～10 ml，提取白细胞DNA，针对线粒体DNA 12Sr RNA1555位点突变设计的一对引物序列进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR），然后将扩增产物用Alw26l限制性内切酶进行酶切反应，不能切开的送测序验证。结果 西北地区245例患者中，86例有氨基糖苷类药物应用史，检测到21例线粒体DNA 12Sr RNA A1555G同质型突变，突变检出率为24.4%（21／86）；东北地区188例患者中，66例有氨基糖苷类药物应用史，检测到2例同质型突变，1例异质性突变，突变检出率为4.5%（3／66），两地区比较差异有显著统计学意义（P＝0.00）。结论 西北地区线粒体DNA 12Sr RNA A1555G突变检出率显著高于东北地区，提示在该地区应加强药物性聋的预防工作。

线粒体DNA； 12Sr RNA； 聋

药物性聋是线粒体遗传相关疾病，目前研究认为，线粒体DNA12SrRNA A1555G突变促进了氨基糖苷类抗生素与12Sr RNA结合，从而导致氨基糖苷类抗生素药物致聋［1］。其耳聋表型的表达受环境因素、核基因背景以及线粒体DNA的单体型影响［2］。我国地域辽阔，遗传性聋有很高的遗传异质性，为了进一步探讨不同地区线粒体遗传性聋的分子流行病学的特点，本研究对西北地区和东北地区433例耳聋先证者进行线粒体DNA 12Sr RNA 1555位点突变检测，并分组进行病因、病史等流行病学调查，报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 研究对象来自于西北地区耳聋患者245例，其中男142例，女103例，年龄1～39岁，中位数15岁；东北地区耳聋患者188例，其中男112例，女76例，年龄2～23岁，中位数16岁。除外综合征型聋以及因炎症、外伤或全身疾病所致的耳聋病例。

1.2 调查方法

1.2.1 填写问卷调查 根据王秋菊等［3，4］采用的遗传性聋资源收集、保存的方法进行聋病流行病学调查，主要包括患者耳聋的发生年龄、发病方式、耳聋的程度、感染史、发育史、母亲的妊娠及分娩史、有无耳毒性药物用药史、有无耳聋高危新生儿疾病史以及有无其他系统疾病等。还需注意父母是否为近亲结婚。对部分没有得到详细病史资料的学生通过电话询问的方式进行补充调查，完善问卷调查的内容。

1.2.2 全身及耳鼻咽喉科常规检查［5］特别注意全身发育、眼部及甲状腺的检查，以初步排除综合征型聋，排除因中耳炎、脑膜炎、病毒性脑炎、腮腺炎及全身感染等因素所致的耳聋。

1.2.3 临床听力学检测与评估 应用纯音测听检测听力损失程度；按照Van Camp等［6］听力损失分级标准评估听力水平，根据受试者听力较好耳0.5、1和2 k Hz纯音听阈平均值（PTA）进行听力分级（不能配合检查的参考ABR阈值）：21～40 dB HL为轻度聋；41～70 d B HL为中度聋；71～95 dB HL为重度聋；＞95 dB HL为极重度聋。2岁以前听力下降为语前聋，2岁以后听力下降为语后聋。应用Madsen901（丹麦）声导抗检测仪进行鼓室导抗图及镫骨肌反射的检测，了解中耳传导状况；应用美国智听公司Smart EP 3.X听觉诱发电位仪行听性脑干反应检查，测定反应阈值及判断是否存在蜗后病变。

1.3 基因检测方法 所有耳聋患者及家系成员签写知情同意书。抽取所有患者及家系成员静脉血5～10 ml，用酚氯仿法提取白细胞DNA。采用王秋菊课题组针对线粒体DNA 12Sr RNA1555位点突变设计的1对引物序列、反应条件和反应体系［7］，引物由上海生工公司合成，其他试剂由大连宝生物公司生产。PCR反应体系在ABI公司9700热循环仪完成。PCR反应结束后，取每种PCR产物和标准Marker各2μl，分别加入6μl溴酚蓝，用1.5%琼脂糖凝胶进行产物纯度和浓度的检测。然后取扩增产物6μl，加入Alw26l限制性内切酶0.2μl和6×Buffer2μl，加水至20μl，在37℃水浴箱中温育消化3小时，再次经琼脂糖凝胶电泳验证酶切结果，酶切切开者电泳显示为300 bp和500 bp两个条带，而不能切开的则为800 bp一个条带。为验证酶切结果的准确性全部送测序验证。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.5软件的列联表（Grosstabs）对两地区的结果差异进行卡方检验。

2 结果

所有耳聋患者均为双侧感音神经性聋。经统计学分析，西北地区与东北地区耳聋患者在发病年龄、听力损失程度和基因突变检测结果的差异均有统计学意义（P＜0.01）（表1）。线粒体DNA12Sr RNA A1555G突变均发生在有氨基糖苷类药物应用史的患者中。西北地区的突变检出率为24.4%（21／86），东北地区为4.5%（3／66）。

表1 两地区耳聋先证者的病因、病史、听力损失程度及基因突变检测结果（例）

3 讨论

目前研究普遍认为药物性聋与遗传密切相关，线粒体DNA 12Sr RNA A1555G的突变可造成患者对氨基糖苷类药物易感性，是常见的致聋因素。研究药物性聋的流行病学对药物性聋的致聋机制研究尤为重要。我国幅员辽阔，民族众多，人口分布和地域环境复杂多变，西北地区与东北地区地域环境、人口分布、风土人情等都存在较大的差别，针对遗传与环境的相关研究难度很大，群体遗传规律以及遗传与环境相互作用对药物性聋存在哪些影响，是相关研究必须面对和亟待解决的问题。因此，开展药物性聋的区域性流行病学调查，根据不同地区、不同人群中线粒体基因的突变特点，有针对性的进行研究，更能够客观的反映我国药物性聋的现状。

本研究结果显示，西北地区和东北地区均有三分之一以上的患者存在着滥用耳毒性药物的问题，线粒体DNA 12Sr RNA A1555G突变均发生在有耳毒性药物应用史的患者中，在有氨基糖苷类药物应用史的患者中，西北地区的A1555G突变检出率为24.4%（21／86），东北地区的突变检出率则为4.5%（3／66），两地区线粒体A1555G突变率存在差别，且发病年龄和耳聋表型方面两地区也存在差异（P＜0.01），但由于样本量较少，尚需要实验设计的不断完善以及足够样本量的研究进一步验证。线粒体DNA的其他致聋位点的突变是否存在差异还需要继续研究。线粒体DNA1555位点的突变使得耳毒性药物与该位点的结合更容易，可能是导致药物性聋的发病率明显提高的原因。由此看来，通过线粒体DNA 12Sr RNA A1555G突变检测，对其突变家系的全体成员进行有效的遗传咨询和用药指导，严格控制氨基糖苷类抗生素等耳毒性药物的应用范围和剂量等，为减低此类耳聋的发生有重要的作用。

1 Li XM，Guan MX.A human mitochondrial GTP binding protein related to tRNA modification may modulate phenotypic expression of the deafness－associated mitochondrial 12S r RNA mutation［J］.Molecular and Cellular Biology，2002，22：7 701.

2 徐延军，曹菊阳，白琳娜，等.线粒体DNAA1555G和G7444A双重突变导致的非综合征型遗传性耳聋［J］.中华耳科学杂志，2005，3：263.

3 王秋菊，杨伟炎，韩东一，等.遗传性耳聋资源的收集、保存及利用——综合系统的建立［J］.中华耳科学杂志，2003，1：65.

4 Stephens D，Lewis P，Davis A.The epidemiology of hearing problem：how should we investigate it［J］？Acta Otolaryngology，2004，522（suppl）：13.

5 谢鼎华，杨伟炎.耳聋的基础与临床［M］.长沙：湖南科学技术出版社，2007.116～149.

6 http：／／webhost.ua.ac.be／hhh／varia.Van Camp G，Smith RJH.Hereditary hearing loss homepage.Recommendations for the description of genetic and audiological data for families with nonsyndromic hereditary hearing impairment.

7 郭玉芬，徐百成，韩东一，等.中国西北地区线粒体DNA 12Sr RNA A1555G和GJB2基因突变［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2006，13：666.

（2009－12－09收稿）

（本文编辑 雷培香）

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.021

R764.43

A

1006－7299（2010）04－0387－02

1 天津市泰达医院耳鼻咽喉头颈外科（天津 300457）； 2 兰州大学第二医院耳鼻咽喉头颈外科

郭玉芬（Email：eygyf＠yahoo.com）