顺铂对离体C57小鼠耳蜗毛细胞的损害作用

曾珊 于栋祯 陈正侬 陈斌

顺铂对离体C57小鼠耳蜗毛细胞的损害作用

曾珊1于栋祯1陈正侬1陈斌1

目的 探讨离体培养条件下顺铂致C57小鼠耳蜗毛细胞损伤的特点。方法 出生后3～4天的C57小鼠耳蜗基底膜离体培养6～8小时后，加入不同浓度的顺铂（0、10、50、100、400、1 000μmol／L）无血清培养液继续培养48小时，其中0μmol／L为正常对照组，10～1 000μmol／L组为实验组，0～100μmol／L4组，每组各7只耳蜗，400和1 000μmol／L两组各6只耳蜗。采用TRITC－Phalloidin和DAPI染色，荧光显微镜下观察耳蜗毛细胞生长情况并拍照计数、绘制毛细胞缺失图，运用SARS 8.0软件进行直线回归分析比较各组的毛细胞缺失率。结果对照组耳蜗基底膜毛细胞在离体培养条件下生长良好，偶见缺失。实验组中顺铂引起毛细胞的缺失程度从底回至顶回大致均匀。随着顺铂浓度从10μmol／L增加到100μmol／L，毛细胞的缺失率从14.5%上升到78.4%；顺铂浓度升高至400μmol／L及1 000μmol／L时，毛细胞缺失率下降至48.8%和8.77%。细胞缺失区域可见DAPI着色的浓缩核。结论 离体培养条件下，顺铂对耳蜗毛细胞的损伤在一定浓度范围内呈剂量依赖性，超过一定剂量后顺铂所致毛细胞损伤又逐渐减少；内外毛细胞的损伤从底回至顶回呈现均一性。

听毛细胞； 耳蜗； 器官培养； 顺铂

顺铂是一种广泛使用的化疗药物，可以有效地治疗卵巢癌、睾丸癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌以及各种头颈部软组织恶性肿瘤，使用顺铂进行化疗的患者中约75%～100%会发生不同程度的听力损失［1］。关于顺铂耳毒性的临床报告和动物实验研究已有大量报道［1，2］，但都是在体实验观察顺铂作用后实验动物的听觉电生理改变。研究顺铂在内耳的作用靶点，对于离体培养条件下顺铂对小鼠耳蜗内、外毛细胞的损伤情况尚不清楚。本研究选用新生C57小鼠耳蜗，在离体条件下使用不同浓度顺铂培养液对其基底膜组织进行培养，观察顺铂对离体耳蜗毛细胞的损害作用及特点。

1 材料与方法

1.1 实验材料及分组 取出生3～4天的C57小鼠耳蜗40只（由上海中科院动物房提供），以无血清培养液中所含顺铂的不同浓度分组，其中顺铂浓度分别为0、10、50、100μmol／L组各7只耳蜗，400和 1 000μmol／L组各6只耳蜗。0μmol／L组为对照组，其余各组为实验组。

1.2 培养用液的配制

1.2.1 胶原凝胶（Collagen Gel）：A：鼠尾胶（Rat tail collagen，每0.02 N乙酸中含3.76 mg／ml，BD－354236）；B：2%碳酸钠（sodium carbonate）；C：10×无血清培养液（basal medium eagle，sigma－B9638）。每次培养前按照A：B：C＝9：1：1的比例混合均匀滴加于直径35 mm的无菌培养皿内，室温下超净台内静置20分钟左右，加入适量无血清培养液，置37℃CO2恒温培养箱内预热备用。

1.2.2 无血清培养液（Serum－Free Medium） 每 200 ml中含有2 g小牛血清白蛋白（BSA，sigma A9647）、2 ml无血清添加剂（Serum－free supplement I1884）、4.8 ml 20%葡萄糖（sigma G7021配制）、0.4 ml青霉素G（sigma P3032－10Mu）、2 ml 200 mmol／L L－谷氨酰胺（sigma G6392）和190.8 ml 1×BME（sigma I1552）。

1.2.3 2 mmol／L顺铂储存液 培养前使用无血清培养液新鲜配制。

1.3 耳蜗基底膜取材 使用75%的酒精喷洒动物的头部及全身进行消毒，断头后剪开顶骨，体视显微镜下（×10）去除脑组织暴露颅底。尖镊小心分离听泡周围软组织后，完整取下听泡浸入Hanks液中。由蜗孔小心打开听泡清除骨性结构，用游丝镊去除耳蜗螺旋韧带，紧贴骨螺旋板将基底膜完整分离后，平铺于准备好的胶原凝胶表面，置37℃CO2恒温培养箱内。

1.4 培养及给药 基底膜培养6～8 h后更换含顺铂浓度分别为0、10、50、100、400、1 000μmol／L的无血清培养液（各为2 ml），继续培养48小时后终止。

1.5 毛细胞染色 培养终止后基底膜用10%福尔马林溶液固定过夜（4℃冰箱），染色前使用0.01 mol／L PBS充分漂洗，基底膜及凝胶一同置25 ng／ml TRITC－Phalloidin溶液中（使用蒸馏水按1：200比例稀释原液后4℃保存，可反复使用）避光染色20～30分钟。再次充分漂洗后，置100 ng／ml DAPI染液中（临用前使用0.01 mol／L PBS按1：1000比例稀释DAPI储存液）避光复染10～15分钟，PBS漂洗后制作玻片，避光－20℃冰箱保存。

1.6 标本观察及结果分析 采用Nikon Eclipse 80i荧光显微镜在激发光540／25 nm发射光565 nm波长下观察染色的基底膜标本并计数摄片。以0.24 mm为一个视野从顶回至底回进行毛细胞计数，Phalloidin染色阳性的红色荧光存在则认为毛细胞仍然存活，计为一个细胞。计数结果输入电脑采用LS软件进行分析，将全基底膜分为10段绘制毛细胞缺失图。毛细胞图中曲线显示的是将全基底膜分为10段后，从距离蜗尖总长度的10%开始至底回钩端（100%）（X轴）内、外毛细胞数与正常C57小鼠内、外毛细胞数相比的缺失百分比（Y轴）。

1.7 统计学方法 将毛细胞计数结果输入LS软件分析并绘制毛细胞缺失图，导出缺失百分比数据，使用SASS8.0软件进行直线回归分析。

2 结果

2.1 顺铂致耳蜗毛细胞缺失的特点 对照组耳蜗内、外毛细胞及支持细胞排列整齐，纤毛及表皮板轮廓清晰，基底膜外周新生上皮细胞生长良好，DAPI复染可见细胞核内散在且清晰的染色质颗粒（图1）。

随顺铂浓度从10μmol／L到100μmol／L增高，实验组基底膜耳蜗内、外毛细胞数量逐渐减少，毛细胞排列变得紊乱，纤毛及表皮板形态发生改变，支持细胞形态破坏，外周新生上皮细胞逐渐减少。当顺铂浓度进一步增高至400μmol／L和1 000 μmol／L时，细胞排列重新变得较为整齐，缺失也明显减少（图2）。实验组DAPI染色可见毛细胞及支持细胞缺失区域细胞核浓缩（图3、4）。

2.2 毛细胞缺失程度及统计分析结果 随着顺铂浓度的增加（10～100μmol／L），距离蜗尖30%～80%段基底膜处（机械损伤因素基本没有）平均毛细胞缺失率从14.5%上升到78.4%，随着顺铂浓度进一步增大至400μmol／L，毛细胞缺失率降低至48.8%，至1 000μmol／L条件下，细胞缺失率进一步降低为8.77%；对照组的毛细胞缺失率为0.67%。直线回归分析结果显示在顺铂浓度0～100μmol／L范围内，全部10个节段基底膜的毛细胞缺失率与顺铂浓度（对数值）均呈直线正相关，相关系数t检验结果（P均小于0.0001）。在顺铂浓度400～1 000μmol／L范围内，全部10段基底膜的毛细胞缺失率与顺铂浓度（对数值）呈直线负相关，相关系数t检验结果P值70%在α＝0.05水平有统计计学意义（图5，表1）。由图5可见从顶回至底回，在顺铂作用下，毛细胞呈基本均匀的缺失，并在一定范围内呈剂量依赖性。培养前期过程中（加药之前）为了防止基底膜漂浮而控制培养液用量，顶回靠近蜗尖部位的毛细胞更接近液体表面，或接触液体量很少，故而损失略重。

图1 对照组耳蜗基底膜（×40）

图2 各组动物耳蜗基底膜（×40）

图3 对照组、顺铂浓度为100及1 000μmol／L培养条件下小鼠耳蜗基底膜DAPI染色图像

图4 对照组、顺铂浓度为100及1 000μmol／LDAPI染色图片

图5 各组的毛细胞缺失图

表1 耳蜗基底膜各段毛细胞缺失程度与顺铂浓度关系统计结果

3 讨论

本研究采用离体培养方法，观察不同浓度的顺铂对耳蜗毛细胞的损伤特点，结果发现，在离体培养条件下顺铂对耳蜗毛细胞的损伤在一定浓度范围内呈剂量依赖性，超过一定损伤剂量后细胞缺失逐渐减少；顺铂对耳蜗内、外毛细胞及支持细胞的损伤没有特异性，内、外毛细胞的缺损从底回至顶回呈现均一性。

以往的研究发现庆大霉素等氨基糖苷类抗生素对耳蜗的损伤呈现剂量依赖性［3］。与氨基糖苷类抗生素所致耳蜗毛细胞损伤不同，本研究发现顺铂对毛细胞的损害并不随顺铂浓度的升高持续增大，在低浓度时，随着顺铂浓度的升高损伤逐渐增大，但当顺铂浓度进一步增高至400、1 000μmol／L时，毛细胞损害减轻。导致这种毛细胞特征性损害的原因可能与顺铂进入细胞的方式有关。有研究表明，顺铂进入细胞及核内是通过包括CTR1、ATP7A和ATP7B等铜转运蛋白实现的［4，5］，其转运及排出与铜离子存在竞争抑制的关系，且进入细胞的速度较铜慢很多［4］。另外，Holzer等［6］对卵巢癌细胞进行离体培养发现，使用0.5μmol／L顺铂作用5分钟即能触发包括内源性及外生型人hCTR1的表达水平减少，顺铂浓度为2μmol／L时hCTR1表达几乎完全消失，从而使得铜摄取减少和卵巢癌细胞耐药性增加，提示可能随着顺铂浓度的增加，细胞膜上铜转运蛋白CTR1表达减少，从而使得高浓度顺铂条件下细胞对顺铂的摄取减少而致损伤减轻。

氨基糖苷类抗生素对毛细胞的损伤表现为随剂量增大而从底回向顶回逐渐进展［3］，而本研究中，顺铂引起毛细胞的缺失程度从底回至顶回大致均匀，内外毛细胞损伤基本同步，且对毛细胞和支持细胞的损害没有选择性。在低浓度时（如10μmol／L，相当于3 mg／l）可见内、外毛细胞大致相同程度的缺失，当顺铂浓度增大到100μmol／L时，内、外毛细胞连同支持细胞及周边上皮细胞几乎损失殆尽，提示，在离体情况下内、外毛细胞对于顺铂的抵抗力可能无差别。van Ruijven等［7］的在体实验中使用2 mg／kg－1·d－1顺铂连续作用4～8天后，发现顺铂对Corti器的损伤主要发生在外毛细胞，与本研究的离体实验结果略有不同。这种离体和在体研究结果的差异可能与顺铂浓度以及作用方式不同有关，也可能与内、外毛细胞上铜转运蛋白的表达也有一定的关系，这需要进一步的实验来证实。

此外，与Alam等［8］使用Hoechst 33432观察到顺铂作用以后耳蜗细胞的改变相同，本研究在内、外毛细胞纤毛缺失的区域可以看到DAPI着色的大量浓缩细胞核，证实了顺铂对耳蜗组织的损害是通过诱导凋亡的发生而产生的。

综上所述，顺铂会导致内耳Corti器的损伤，这一损伤的发生是通过诱导细胞凋亡实现的；顺铂所致耳蜗细胞的损伤在一定范围内呈剂量依赖性，超过一定损伤剂量后损害反而减轻，提示在研究顺铂离体损伤和保护机制的过程中，选择培养液时，顺铂浓度不宜过高。

1 Rybak LP，Whitworth CA，Mukherjea D，et al.Mechanisms of cisplatin－induced ototoxicity and prevention［J］.Hear Res，2007，226：157.

2 van Ruijven MW，de Groot JC，Smoorenburg GF.Time sequence of degeneration pattern in the guinea pig cochlea during cisplatin administration.A quantitative histological study［J］.Hear Res，2004，197：44.

3 Cheng AG，Cunningham LL，Rubel EW.Mechanisms of hair cell death and protection［J］.Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg，2005，13：343.

4 Lutsenko S，Petris MJ.Function and regulation of the mammalian copper－transporting ATPases：insights from biochemical and cell biological approaches［J］.J Membr Biol，2003，191：1.

5 Safaei R.Role of copper transporters in the uptake and efflux of platinum containing drugs［J］.Cancer Lett，2006，234：34.6 Holzer AK，Katano K，Klomp LW，et al.Cisplatin rapidly down－regulates its own influx transporter hCTR1 in cultured human ovarian carcinoma cells［J］.Clin Cancer Res，2004，10：6744.

7 van Ruijven MW，de Groot JC，Klis SF，et al.The cochlear targets of cisplatin：an electrophysiological and morphological time－sequence study［J］.Hear Res，2005，205：241.

8 Alam SA，Ikeda K，Oshima T，et al.Cisplatin－induced apoptotic cell death in Mongolian gerbil cochlea［J］.Hear Res，2000，141：28.

（2009－11－17收稿）

（本文编辑 周涛）

CispIatin－Induced Damage of C57 Mice Hair CeIIs in CochIear OrganizationaI CuItures

Zeng Shan，Yu Dongzhen，Chen Zhengnong，Chen Bin
（Department of OtoIaryngoIogy，AffiIiated No.6 PeopIe’s HospitaI，Shanghai Jiaotong University，Shanghai，200233，China）

Objective To investigate the characteristic of the cisplatin－induced damage of hair cells in cochlear organotypic cultures.Methods Three to four－day－old（P3～4）C57 mice were used for this study.The cochlear basilar membrane was cultured for 6～8 hours and then treated with different doses of cisplatin（0μmol／L，10μmol／L，50μmol／L，100μmol／L，400μmol／L，1000μmol／L，7 cochlears for 0－100μmol／L group，6 cochlears for the rest dosage，control group used the dose of 0μmol／L）for 48 hours.TRITC－phalloidin and DAPI were used for stain.The entire cochlear hair cells were observed and counted under Nicon fluorescent microscope.Data was analyzed by LS for hair cells loss graph and SAS 8.0 for linear regression analysis.ResuIts Hair cells loss had rarely been seen in the control group of cochlear tissue under the culture condition.How ever，in cisplatin treated groups，the hair cells loss increased from 14.5%to 78.4%with the concentration of cisplatin increased in the range of 10μmol／L－100μmol／L，while decreased from 48.8%down to 8.77%with the dose getting further higher to 400μmol／L and 1000μmol／L.Apoptosis was confirmed by the DAPI stain in the hair cells loss area.The hair cell loss shows no difference from the apex to the basal turn of the basilar membrane.ConcIusion Cisplatin－induced hair cell death shows characteristic damage that it is dose－dependent in a certain range of dosage，and it decreases when the cisplatin dose higher than the one caus maximal damage under the condition of cochlear organotypic cutures.Apoptosis happens evenly in inner and outer hair cells in all turns of basilar membrane.

Auditory hair cell； Cochlea； Organizational cultures； Cisplatin

R764.5

A

1006－7299（2010）04－0367－05

1 上海交通大学附属第六人民医院耳鼻咽喉科，上海交通大学耳鼻咽喉科研究所，上海交通大学眩晕疾病诊治中心（上海 200233）

曾珊，女，湖南人，医学硕士在读，研究方向：耳聋的基础研究。

陈斌（Email：binchendoc＠126.com）

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.016