几种理化因子对急性感染WSSV凡纳滨对虾的影响*

陈勇贵，梁秋玲，何建国,

(1.中山大学海洋学院，广东 广州 510275;2.中山大学生命科学学院，广东 广州 510275)

凡纳滨对虾Litopenaeusvannamei是世界主要对虾养殖品种，也是中国对虾养殖区的主要养殖品种。由白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)引起的白斑综合症(White Spot Syndrome，WSS)是凡纳滨对虾最主要病害之一。WSSV的潜伏感染现象很普遍，在养殖季节，对虾养殖区内的WSSV宿主的感染率高达80%[1-2]，虾苗、成虾以及亲虾都可以携带WSSV[1,3-8]。对虾WSSV潜伏感染在水体理化因子胁迫下可转化为急性感染导致WSS的暴发流行。因此，养殖环境胁迫严重时该病暴发导致养殖失败，引起巨大的经济损失[9-10]。水体理化因子在WSS的暴发流行中起到激发作用[1,10]。我们通过人为改变养殖海水的理化因子，研究了多种理化因子对急性感染WSSV的凡纳滨对虾平均存活时间的影响。结果报导如下。

1 材料和方法

1.1 健康凡纳滨对虾

凡纳滨对虾在10 m3的水泥池中养成。实验时对虾平均体长(7.5±0.51) cm，平均体质量(3.71±0.550) g。实验前将对虾从水泥池移入实验室后于天然海水中暂养7 d。实验前随机抽取30尾作WSSV PCR检测[11]，均呈阴性。选取肢体完整，活力好，无其它病症的对虾进行实验。

1.2 患病凡纳滨对虾

患WSS的凡纳滨对虾体长7.0～8.0 cm，头胸甲及腹部甲壳上有大量白斑。经WSSV PCR一步法检测呈阳性。用病虾肌肉组织投喂健康凡纳滨对虾，后者出现WSS病症并死亡。病虾置-85 ℃冰箱保存备用。

1.3 天然海水

1.4 各因子的设置

实验所用的NaCl、NH4Cl、NaNO2、HCl、NaOH等均为广州化学试剂厂生产的分析纯。

表1 实验设置1)

1)“—”表示天然海水中该因子的本底质量浓度

1.5 WSSV粗提液的制备

WSSV粗提液用患WSS的凡纳滨对虾制备。剪取病虾腹部肌肉组织按1∶10(W∶V)的比例加入无菌磷酸缓冲液(PBS: 800 mL dH2O，8.00 g NaCl，0.20 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.20 g KH2PO4， HCl调节pH至7.4，加dH2O至1 L，高压灭菌)，用玻璃组织研磨器冰浴研磨，用0.45 μm的微孔滤膜在4 ℃下过滤。经实时定量PCR检测[12]，此时滤液的病毒浓度为1.29×108copies/mL。用PBS稀释100倍、10 000倍后0.05 mL的溶液中含WSSV的数量分别为64 500 copies、645 copies。

1.6 感染方法

感染时用无菌注射器注射对虾，注射部位于对虾的第2和第3腹节之间连接处侧面，向心进针约0.5～1.0 cm，实验组每尾注射0.05 mL WSSV粗提液。对照组每尾注射0.05 mL PBS溶液。注射后将对虾移入准备好的试验海水中。

1.7 养殖管理

实验期间每天投喂对虾配合饲料1次，清污2次。每24 h换试验海水1次，换水量100%，试验海水按1.4方法备制，即备即用。24 h连续通气。病死虾(玻璃棒触碰无反应者)及时移走，并作记录。

1.8 数据处理

所有数据用SPSS10.0统计软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 凡纳滨对虾的平均存活时间

对虾的存活时间为注射后到死亡时之间的时间间隔，如果实验结束时尚未死亡，则以注射后到实验结束时之间的时间间隔为存活时间。

第1次实验结束时(336.0 h)，各组对虾存活状况各不相同。其中，有对虾存活的实验组有：第1组有5尾生存，第5组有9尾生存，第8组有1尾生存，第11组有10尾生存，第14组有3尾生存。其余各组全部死亡。第2次实验结束时(336.0 h)，各组对虾存活状况也各不相同。其中，有对虾存活的实验组有：第1组有2尾生存，第5组有8尾生存，第11组有10尾生存，第12组有1尾生存，第14组有1尾生存。其余各组全部死亡。各种因子影响下凡纳滨对虾平均存活时间见表2。

表2 不同处理的凡纳滨对虾的平均存活时间1)

1) MST: Mean Survival Time; TMST: Total Mean Survival Time

2.2 各因素对凡纳滨对虾平均存活时间影响的大小

图1 不同因素水平下凡纳滨对虾的平均存活时间

2.3 理化因子与对虾平均存活时间关系的回归分析

Y=421.894-28.448X1-1.086X2-1.44×10-3X3-1.965X4(R=0.688)

从这一方程可以看出，WSSV要对凡纳滨对虾的平均存活时间产生影响，注射的量必须达到103copies以上。在一般的海水中(pH≈8.0)，如果注射的WSSV的数量达到103copies，那么凡纳滨对虾可存活的时间为：193 h (大约8 d，421.894-28.448×8.0-1.44×10-3×103≈193, 氨氮，亚硝基氨含量较少，均在10-1mg/L数量级以下，在此为了计算方便将这两项忽略)。换言之，在一般的感染实验中，注射WSSV后193 h，如果对虾尚未出现死亡，则意味着感染失败或WSSV已经转入潜伏感染(可进行PCR二步法确认)；同时，从方程还可以看出，养殖水体的pH每下降一个单位，平均存活时间就增加28.448 h。可见，养殖水体pH值的变化对平均存活时间的影响很大。

本实验所得出的数学模型没有将因素之间可能存在交互作用考虑在内。所以，当所考查的因素的交互作用不大时，或者所考查的单个因素的水平对对虾的平均存活时间影响不是很大时，该模型是适用的。但是，当所考查的因素的交互作用很大时，或者所考查的单个因素的水平对对虾的平均存活时间影响很大时，该模型可能还不够精确。

3 讨 论

在人工感染实验中感染了WSSV的养成期对虾死亡率最高可达100%，但对于不同的对虾种类采用不同的感染方式和不同的感染剂量，感染后的死亡时间略有差别[1,7,13,14]。本实验中，用不同数量WSSV注射凡纳滨对虾，死亡时间和死亡率都不相同，也印证了这一的观点。

在本试验中，亚硝基氮质量浓度的增加能缩短凡纳滨对虾的平均存活时间。实际上，养殖水体中亚硝酸盐是氨在亚硝酸单胞菌(Nitrosomomas)的作用下形成的。在溶氧充足时，亚硝酸盐可在硝酸杆菌(Nitrobacter)作用下被氧化成硝酸盐。而在缺氧条件下，又可转化为氨氮[21]。亚硝酸盐是强氧化剂，动物体吸收进入血液后能使血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁，导致低氧血症，使各组织缺氧。甲壳类动物血液中的血蓝蛋白，其辅基是含铜的化合物，在亚硝酸盐的参与下，可能发生与血红蛋白相似的反应，从而引起缺氧和青紫症[22]。亚硝酸盐浓度升高时，虾体内溶菌酶、PO和SOD的活性显著下降，血细胞数目明显减少[23]。高浓度的亚硝酸盐还能使试验虾肝胰腺、胃、中肠和鳃等组织产生异常变化，出现从细胞肿胀到空泡化、坏死等一系列的组织病理学变化[24]。亚硝基氮对MBV的感染度也有明显的影响[17]。

盐度可以影响病毒的复制速率，如在较高盐度下，感染有对虾传染性皮下与造血组织坏死病毒(IHHNV)的对虾生长比阴性对照者减慢[25]。盐度也是影响MBV感染度的重要因子之一[17]。但本实验中盐度与受WSSV急性感染的凡纳滨对虾的平均存活时间的相关系数没有达到显著水平。可能是因为盐度对对虾的诸多方面影响是长期的效应，短期内没有得到体现。

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