酶解法定量测定葡聚糖的研究

葡聚糖为白色的无定形粉末固体，无臭无味，易溶于水，不溶于酒精[1]。制糖过程中葡聚糖主要是肠膜明串珠菌分解的酶消耗蔗糖所生成的具有高粘性的物质[2]，当其含量达到一定程度时，其高粘性不仅造成甘蔗汁过滤、浓缩、结晶等后续操作困难，而且还造成糖分大量损失[3]。因此，定量分析制糖过程中葡聚糖含量至关重要。

目前国内外葡聚糖测定方法虽然很多，但缺点都比较明显。如Roberts-铜法需反复洗涤、多次过滤，操作步骤过多，使得测定结果误差大；Haze-酒精沉淀法操作复杂、对时间要求严苛、测得吸光度值过小等。因此，寻求一种操作简单、准确度高、重复性好的萄聚糖定量测定方法势在必行。

葡聚糖酶属于葡聚糖水解酶系，可以专一地分解葡聚糖，将葡聚糖降解成水溶性的还原糖[4],因此，可以通过测定还原糖的量，来定量推算葡聚糖的含量。酶解法定量测定葡聚糖因所用葡聚糖酶具有高效专一性、重复稳定性好、样品前处理简便等特点，有望成为较有前景的葡聚糖定量测定方法。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

甘蔗汁由广州甘蔗糖业研究所育种室提供；原糖由广州甘蔗糖业研究所检测中心提供。

醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.1 mol·L-1醋酸+0.1 mol·L-1醋酸钠，pH=5.0)；其余试剂均为国产分析纯。

UV-2102PC型紫外分光光度计，Unico公司；AL204型电子天平、Seven Multi型pH计，Mettler toledo公司；DK-S24型电热恒温水浴锅，上海宏精实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

在标号为1#～10#的比色管中分别加入0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL的1%的葡萄糖标准溶液,并补加蒸馏水至1 mL，其中0#比色管作为空白调零，然后依次加入2 mL DNS试剂，于沸水中煮沸5 min，迅速冷却，用蒸馏水定容至25 mL， 30 min后于540 nm处测定OD值。以葡萄糖浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2 最适酶解时间的确定

用醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制pH值为5(葡聚糖酶的最适酶解pH值)的浓度分别为1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1T500葡聚糖标准溶液。各取0.5 mL标准溶液并加入0.5 mL酶活为200 U·mL-1的葡聚糖酶在55℃的水浴中分别反应不同时间后，迅速灭活，加入2 mL DNS试剂进行比色测定，同时做灭活样对照。

1.2.3 回收率实验

1.2.3.1 标准样的回收率实验

标准样的回收率即葡聚糖酶在最适酶解时间内对葡聚糖的分解率。

分别用T40、T500、T2000的葡聚糖配制浓度为1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1的标准溶液。各取0.5 mL标准溶液，加入0.5 mL 200 U·mL-1的葡聚糖酶在55℃的水浴中分别反应20 min、60 min、90 min、120 min, 迅速灭活，加入2 mL DNS试剂进行比色测定，同时做灭活样对照。

1.2.3.2 试样加标回收率实验

取新鲜甘蔗汁，用Roberts-铜法[5]测定葡聚糖含量；再在酶解法的沉淀溶解液中加入5 mL 0.2 mg·mL-1T500葡聚糖标准溶液；最后用酶解法测定混合液的葡聚糖含量，计算回收率。

1.2.4 酶解法与Roberts-铜法的对比实验

酶解法测定甘蔗汁中葡聚糖含量：取经过定性滤纸过滤的甘蔗汁5 mL，加入20 mL酒精，摇匀；在18 000 r·min-1、室温条件下沉淀离心10 min；倒出上清液，取pH值为5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液5 mL，使离心沉淀溶解；取沉淀溶解液进行比色测定，同时做灭活样对照。在不同时间段取样测定比较。同时采用Roberts-铜法测定甘蔗汁中葡聚糖含量。对比两方法结果。

1.2.5 酶解法与Haze-酒精沉淀法[6]的对比实验

酶解法测定原糖中葡聚糖含量：称取3.0 g原糖，溶解于100 mL蒸馏水中，取溶解液5 mL，加入20 mL酒精，摇匀，后续操作同1.2.4。同时采用Haze-酒精沉淀法测定原糖中葡聚糖含量。对比两方法结果。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制(图1)

图1 葡萄糖标准曲线

由图1可知，葡萄糖浓度与OD值在0.1～1.0 mg·mL-1浓度范围内呈线性关系，拟合方程为y=0.8372x-0.0547，相关系数R2=0.9999。

2.2 最适酶解时间的确定

不同浓度T500葡聚糖酶解产物的还原糖含量与酶解时间的关系见图2。

图2 不同浓度葡聚糖标准溶液最适酶解时间

由图2可知,最适酶解时间随葡聚糖标准溶液浓度的不同而不同。葡聚糖酶对浓度为0.5 mg·mL-1、0.75 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1的T500葡聚糖标准溶液的最适酶解时间分别为20 min、60 min、90 min、120 min。

2.3 标准样的回收率

葡聚糖酶酶解不同分子量葡聚糖的标准溶液，酶解产物的还原糖含量与萄聚糖浓度的关系见图3。

图3 不同分子量葡聚糖的标准溶液经酶解后产生的还原糖含量

由图3可知,葡聚糖酶对不同分子量葡聚糖的分解率是相等的，分解率为56.0%。

2.4 试样加标回收率(表1)

表1 甘蔗汁中葡聚糖的回收率测定

从表1可以看出，甘蔗汁中葡聚糖的回收率结果良好，回收率在(100±5)%之间，因而可以肯定葡聚糖酶对葡聚糖的分解是专一性的。

2.5 酶解法与Roberts-铜法、Haze-酒精沉淀法比较

将透光度OD值分别代入标准曲线y1=0.8372x1-0.0547(酶解法标准曲线)、y2=0.9576x2+0.0073(Roberts-铜法标准曲线)和y3=0.000147x3+0.003168(Haze-酒精沉淀法标准曲线)，换算后得到葡聚糖含量，如表2、表3所示。

表2 酶解法与Roberts-铜法测定甘蔗汁中葡聚糖含量对比

表3 酶解法与Haze-酒精沉淀法测定原糖中葡聚糖含量对比

从表2、表3可以看出，酶解法与Roberts-铜法及Haze-酒精沉淀法测定葡聚糖含量相差不大，误差均不超过±10%，在制糖误差允许范围之内。用Roberts-铜法测定甘蔗汁中葡聚糖含量时，其相对误差主要表现为正误差，这可能是因为Roberts-铜法需反复洗涤、多次过滤，操作步骤过多，使得葡聚糖流失过多。

3 结论

(1)葡聚糖酶对不同分子量葡聚糖的分解效果是相同的，分解率为56.0%。

(2)最适酶解时间随葡聚糖标准溶液浓度的不同而不同。

(3)用酶解法定量测定葡聚糖含量，其测定值与Roberts-铜法及Haze-酒精沉淀法(国标)相差不大，误差均不超过±10%。

(4)酶解法定量测定葡聚糖含量具有高效、专一性强、污染小、操作简单、酶解产物分布稳定等优点、但存在耗时长、葡聚糖酶不能完全分解葡聚糖等缺点。

参考文献：

[1] 吴飒丽.蔗汁中葡聚糖的测定及葡聚糖含量的变化特性研究[D].南宁：广西大学，2007.

[2] 周文红，刘慧霞，张建法，等.葡聚糖含量使糖度测定值虚假增加的影响研究[J].广西糖业，2009，(3)：38-41.

[3] 梁达奉,曾练强,郭亭,等.葡聚糖对制糖工业的影响及对策(上)[J].甘蔗糖业，2008，(3)：28-33.

[4] 谭海平.α-1，6-葡聚糖酶的研究进展[J].国外医学：口腔医学分册，2001，28(1)：14-16.

[5] Roberts Earl J. A quantitative method for dextran analysis[J].Int Sugar J,1983,85(1009): 10-13.

[6] GB 15108-2006，原糖[S].