腈水合酶催化反应液电导率控制研究

腈水合酶是以硫原子和半胱氨酸——亚磺酸残基为绝对中心的能催化腈类化合物转化为相应的酰胺类化合物的同工酶[1,2]。不同菌株所产腈水合酶在结构和特性上存在较大差异。目前已知能产腈水合酶的微生物有红球菌(Rhodococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、假诺卡氏菌(Pseudoncardia)、节杆菌(Arthobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、诺卡氏菌(Nocardia)、丛毛单胞菌(Comamonas)、棒状杆菌(Corynebaterium)及短杆菌(Brevibacterium)[3]。腈水合酶生产菌株最初主要是利用其产生的腈水解酶处理含腈污水，经过诱变培养后，菌株以产腈水合酶为主，用来催化腈类物质与水发生加成反应生成酰胺类物质(如丙烯酰胺)。目前国内利用生物法生产丙烯酰胺的企业已超过10家，每年总产量超过20万t,还有许多公司计划扩建生产装置[4～7]。

腈水合酶催化丙烯腈水合反应技术是生物法生产丙烯酰胺的核心技术。由于菌株在产腈水合酶的同时也产生一定的腈水解酶，其催化反应过程中，不仅催化丙烯腈与水反应生成丙烯酰胺，还催化丙烯酰胺与水发生水解反应生成丙烯酸。反应如下：

催化反应过程生成的反应液由于电导率高而难于精制，不仅耗水量大、废水多、产率低，而且使离子树脂精制塔再生频繁，大大增加了生产成本、严重影响了产品质量。为此，作者对腈水合酶催化反应液电导率的控制进行了研究。

1 实验

1.1 菌种

诺卡氏菌(Nocardia)。

1.2 气相色谱分析条件

柱箱温度190℃，运行时间6 min；进样口模式为分流，分流比40∶1，加热器温度200℃，压力110.5 kPa，载气为氮气，总流量77.7 mL·min-1，分流流量73.2 mL·min-1；色谱柱：毛细管柱，Agilent Q 10.0 m×320 μm×20.0 μm，最高柱温270℃，模式为恒定压力，压力110.5 kPa，额定初始流量1.8 mL·min-1，平均速率59 cm·min-1，出口压力为环境压力；检测器：氢火焰离子检测器，温度250℃，模式为恒定柱流加尾吹，氢气流量30.0 mL·min-1，空气流量300.0 mL·min-1，合并流量30.0 mL·min-1；进样针：注射器尺寸5.0 μL，进样体积1.0 μL。

1.3 分析方法

采用外标分析法(进样量1.0 μL)检测丙烯酸含量；采用EF30K型电导率仪(梅特勒公司)测定电导率。

2 结果与讨论

2.1 影响腈水合酶催化丙烯腈反应液电导率的因素

研究发现，影响反应液电导率的因素主要有加入菌体带入的无机盐和菌体的代谢产物、催化反应过程中由于菌体死亡发生自溶产生的氨基酸等有机类物质、菌体细胞中含有的腈水解酶。

在工业生产过程中，当加入规定量的发酵液离心后的菌体后，测定游离细胞液的电导率为176 μS·cm-1，催化反应结束后测定反应液的电导率为1102 μS·cm-1，反应液中丙烯酸的含量为1429×10-6。为考察丙烯酸含量对反应液电导率的影响，用脱盐水配制不同含量的丙烯酸溶液，并测定相应溶液的电导率，结果见表1。

表1 丙烯酸水溶液电导率

各因素在腈水合酶催化反应中对反应液电导率影响大小分别为：

(1)加入菌体带入的无机盐和菌体的代谢产物产生的电导率所占比例为：

176/1102 =16%

(2)生成丙烯酸产生的电导率所占比例为：

[325+(402-325)×(1429-800)/(1200-800)]/1102 = 41%

(3)菌体死亡发生自溶产生的氨基酸等有机类物质产生的电导率所占比例为：

100%-41%-16% = 43%

因此，当腈水合酶催化反应条件确定后，若要降低反应液电导率，应减少腈水合酶催化反应过程中丙烯酸的生成，即降低腈水合酶生产菌株的产腈水解酶的能力，筛选低产丙烯酸的腈水合酶生产菌株。

2.2 低产丙烯酸腈水合酶生产菌株的筛选

在实际生产过程中，通常按照单菌落的形态选择菌株，光滑型的菌落产生腈水解酶的量少，反应液的电导率可由4112 μS·cm-1降低到2725 μS·cm-1[8]。研究发现，丁烯酰胺对腈水合酶生产菌株具有定向选择作用，当固态平板培养基中丁烯酰胺的含量在1%

左右时，多产腈水解酶的菌株能够存活，而少产腈水解酶的菌株不能存活。利用这一规律进行定向筛选，从而获得低产丙烯酸的产腈水合酶菌株，将其用于催化丙烯腈水合反应，测试反应液电导率，结果见表2。

表2 定向选择菌株对反应液电导率的影响

由表2可知，定向筛选的低产丙烯酸腈水合酶生产菌株能明显降低反应液的电导率。

3 结论

利用含1%丁烯酰胺的培养基对生产菌株进行定向选择，可以获得低产丙烯酸菌株，该类菌株主要产腈水合酶，而产腈水解酶的能力相对低得多。将低产腈水解酶的生产菌株发酵制得的生物催化剂用于催化丙烯腈水合反应，能显著降低丙烯酸产量，控制反应液的电导率在500 μS·cm-1以下。

参考文献：

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