猪口蹄疫O型合成肽与油乳灭活疫苗免疫后抗体水平的比较

司兴奎,罗汝灶,戴宜发,李彦超,朱丽娴

(1.佛山科学技术学院动物医学系,广东 佛山528231;2.佛山市南海区农林技术推广中心,广东佛山528200;3.博罗县温氏畜牧有限公司,广东博罗516157)

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,被OIE列为A类传染病,我国将其列为一类传染病。自1514年FMD首次报道以来,已蔓延至除北美洲和大洋洲外的世界各地,对家畜养殖业的健康发展构成严重威胁。在中国,防制猪O型FMD主要采用灭活疫苗免疫与扑杀等综合性防制措施相结合的方法,收到了较明显的效果。但在使用灭活疫苗控制FMD过程中,由于疫苗质量参差不齐免疫效果不理想,接种灭活疫苗副反应严重,甚至造成死亡等情况,使研究安全、高效的新型口蹄疫疫苗成为研究热点。FMD合成肽疫苗作为新型疫苗免疫后抗体水平与油乳灭活疫苗免疫后的抗体水平的差异尚鲜有报道。鉴于此,本试验拟对猪O型FMD合成肽疫苗与油乳灭活疫苗免疫后机体抗体水平进行比较研究。

1 材料与方法

1.1 材料 口蹄疫病毒O型抗体阻断ELISA检测试剂盒PrioCHECKFMD Type O为荷兰赛迪诊断公司生产(7610420);猪口蹄疫O型合成肽疫苗为中牧实业股份有限公司兰州生物药厂生产(0801000,简称为D疫苗);猪口蹄疫O型灭活疫苗(OZK/93株)为中农威特生物科技股份有限公司生产(0802017J,简称为A疫苗)。

65头51日龄健康的大白×长白×杜洛克×皮特兰四元杂交猪由博罗县温氏畜牧有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物试验 将65头51日龄健康四元杂交猪随机分为5组(13头/组),其中1组为健康对照组,其余4组的疫苗免疫及分组情况见表1。

表1 试验动物分组及疫苗免疫情况

1.2.2 疫苗接种后机体应激反应情况观察 在每次疫苗接种后 24、48、72 h及 96 h后,检测直肠温度、观察饲料摄入情况、记录应激性倒地及呕吐等疫苗接种后的副反应。

1.2.3 免疫抗体水平的阻断ELISA检测 根据试剂盒说明书略作修改进行。具体步骤为:首先将参考血清1～4及待检血清样品以ELISA缓冲液按1∶10进行稀释,每孔加入100 μ L室温感作1 h,倾除孔内液体,洗板4次后拍干;每孔加入100 μ L酶标结合物溶液,室温感作1 h,倾除孔内液体后,洗板4次后拍干;每孔加入 100 μ L底物溶液,避光室温孵育15 min;每孔加入100 μ L终止液后,OD450 nm判读,记录。判定标准参照试剂盒说明书进行,以阻断率不低于50%判定为阳性。

1.2.4 数据表示和分析方法 疫苗免疫各组抗体阻断率的均值(以表示)。采用t检验对不同时相疫苗免疫各组进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 疫苗接种后机体的应激反应情况 在每次疫苗接种后 24、48、72 h及 96 h后,对直肠温度、减料、记录应激性倒地及呕吐等疫苗接种后的副反应,结果见表2。由表2可见,合成肽疫苗注射后副反应轻微,仅表现为减料和轻度发热的情况,而呕吐、应激性倒地等情况均未出现;同比下,油乳灭活疫苗接种后存在一定程度的副反应,特别在首免后48 h内减料、发热均较为严重,个别猪有呕吐、应激性倒地等情况;在二免后的48 h内虽然也有一定程度的副反应,但从群体的反应程度上已减弱;在三免时,各组接种疫苗的副反应基本可以忽略。

2.2 免疫抗体水平的检测结果 根据试剂盒提供的判定方法,参考血清1～4均符合确认标准,在此基础上计算出各血清样品的阻断率,健康对照组的抗体阻断率在首免后 2周,阻断率均值均低于50%,判定为阴性。试验各组的抗体阻断率结果见表3及图1。从图1及表3可见,DD组及DDD组的抗体水平动态变化趋势基本一致,即在首免后2周至4周之间,抗体水平并未呈现上升趋势,推测与母源抗体水平影响有关(除DDD组呈现上升趋势外);在二免后抗体水平不断攀升,并在首免后6周达到峰值并维持至试验结束,3次免疫组在抗体水平达到峰值后较二次免疫组在维持峰值过程中波动相对较小。AA组的抗体水平变化趋势为在首免后2周和4周之间抗体水平呈现下降趋势,在4WPI后抗体水平逐步攀升,在8WPI达到峰值,随后抗体水平逐步下降;AAA组的抗体变化趋势为在首免后2周至 6周内,抗体水平持续下降,在6WPI后逐步攀升,在12WPI前后达到峰值,直至试验结束。

从免疫效果的次序上看,DDD组免疫效果最好,其抗体水平在 4WPI后迅速上升且显著高于AAA组,在6WPI达到峰值,但在 10WPI后迅速下降,从组间不同时相抗体水平比较看:在6～10WPI间,DDD组抗体水平极显著高于AA组和AAA组(DDD组抗体水平在10WPI还显著高于DD组),在4WPI之后DDD组抗体的阻断率一直高于50%;DD组免疫效果位居第二,其抗体水平在4WPI后上升在6WPI达到峰值后略有下降,但在8WPI后略有回升,当升至与6WPI峰值处保持稳定,组间不同时相抗体水平比较结果表明,在4、6、10WPI及12WPI DDD组抗体水平显著高于AAA组(在 6WPI极显著高于 AAA 组),在 6WPI及12WPI DDD组抗体水平还极显著高于AA组;AA组免疫效果位居第3,其抗体水平在8WPI达到峰值,抗体有效期维持7～10WPI之间,组间不同时相的比较结果显示AA组抗体水平在4WPI及6WPI显著高于AAA组;AAA组免疫效果最差,在10WPI接近保护值,且维持较平稳的状态,直至试验结束。

表2 疫苗接种后机体应激反应情况

表3 免疫后各组血清样品的抗体阻断率(%)

3 讨论

口蹄疫是一种偶蹄动物烈性、高度传染性疾病,给世界畜牧业造成很大损失。目前,我国养猪业普遍使用的是猪口蹄疫油乳灭活疫苗。但猪口蹄疫O型油乳灭活疫苗生产过程中由于需要加入灭活剂,且存在较高比例的异体蛋白,因此在对生猪免疫时常会出现高热不退、食欲废绝、呼吸困难、流涎、伴有呕吐、全身发绀、站立不稳等异常情况,如不能及时救治部分生猪甚至死亡[1]。本试验中猪口蹄疫O型油乳灭活疫苗接种后副反应情况,进一步证实了上述观点。鉴于此,选择一种能替代或部分替代传统猪口蹄疫O型油乳灭活疫苗的新型疫苗在生产实际中具有非常重要的理论及现实意义。合成肽疫苗是以合成的一段免疫原性肽抗原配以适当的载体或/和佐剂制成的疫苗。相对于传统的弱毒苗和灭活苗以及其他几种新型的疫苗,肽类疫苗具有以下特点:合成肽疫苗是一种纯粹抗原性疫苗具有安全、无毒、稳定及副反应小等优点;由于其分子结构小而简单,很少会出现严重的并发症及医源性感染问题;第三是可精确定位,合成T、B细胞抗原表位并能可进行不同组合,有望制成针对多种病原的超级疫苗[2]。猪口蹄疫O型合成肽疫苗正是基于上述理念研制成功,其主要含有口蹄疫O型病毒VP1 B细胞表位(VP1环)和T细胞表位的7种寡肽,将这些寡肽和钥孔鏚血蓝蛋白(KLH)偶联,然后混合于弗氏完全佐剂中,制备成合成肽疫苗,能够产生足够的抗体,保护牛和猪不发病[3]。本试验中针对猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后的副反应进行观察,发现除接种猪除短时间的发热及减料外,并无常规口蹄疫疫苗接种后的高热不退、食欲废绝、呼吸困难、流涎、伴有呕吐、全身发绀、站立不稳等情况也证实了合成肽疫苗安全、稳定及副反应小等特点[1]。

通过猪口蹄疫O型合成肽疫苗与油乳灭活疫苗的比较,不难看出猪口蹄疫O型合成肽疫苗不但可诱导较油乳灭活疫苗更高水平的特异性抗体,并抗体维持时间较长;且猪口蹄疫O型合成肽疫苗3次免疫组在抗体水平达到峰值后较二次免疫组在维持峰值过程中波动相对较小,在生产实践中对于预防猪口蹄疫O型将具有更加积极的作用。

[1]朱玉华,陈亮.生猪注射口蹄疫灭活苗引起免疫应激的防治[J].安徽农学通报,2007,13(18):223.

[2]鱼艳荣,张彦明,刘希成.多肽疫苗抗病毒作用研究进展[J].中国预防兽医学报,2001,23(6):480-482.

[3]王世若,王兴龙,韩文瑜.现代动物免疫学[M].长春:吉林科学技术出版社,1996:320-321.