单味及复方中药的双频复合超声提取效果对比研究

贲永光， 丘泰球， 李 康

（1.广东药学院药科学院，广东广州 510006;2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）

关于用超声提取中药复方的文献报道非常少见，现有的文献报道中，绝大多数采用单频辐照方式。有关双频超声辐照的声化学反应规律的基础研究则是近年来的事，因其显著地增加空化事件，减少驻波所造成的死角，提高声化学产额，它已引起国际上不少研究单位的浓厚兴趣。朱昌平［1］等用碘释放法研究了28 kHz分别与0.87 kHz、1.06 kHz，1.7 kHz组成的双频超声辐照的声化学效应。发现双频辐照增大声化学产额存在着明显的频率效应。沈壮志［2］等研究双低频超声辐射对碘化钾溶液碘释放量影响的研究，结果表明双频辐射碘释放量约为单频的2倍，有的甚至高达5倍左右。曹雁平［3］等采用均匀设计研究28 kHz和40 kHz单频超声、双频组合超声（先28 kHz超声接着40 kHz超声）和双频复合超声（28 kHz超声和40 kHz超声同时工作）浸提绿茶多酚，结果表明:双频复合超声浸取绿茶茶多酚在浓度、浸取率和浸取速率三个方面都优于单频超声和双频组合超声。在所研究的各种频率组合情况下，双频同时辐照的综合效应均明显大于各频率单独辐照效应。徐飞［4］等用超声提取复方六味地黄丸，研究发现超声提取效果明显优于回流提取法，具有省时、省工、提取率高等特点。目前用双频复合超声提取技术对中药复方进行提取工艺的研究及新药开发还是一个空白。超声技术提取中药具有提取效率高、低温、省时、节能等优点，但目前几乎局限于单味中药的提取，而中医用药多以复方制剂为主，药物发挥的是多成分、多靶点的综合治疗作用，使超声技术受到了限制，中药复方采用双频复合超声提取技术目前还是个空白。

本实验选择单味药丹参、单味药三七及由丹参和三七两味药组成的复方丹参三七作为研究对象，采用双频复合超声（25 kHz/40 kHz）强化提取单味药及复方中药有效成分，并对单味药和复方中药的双频复合超声提取效果进行检验分析。

1 仪器和材料

1.1 材料

丹参（批号:021116）和三七（批号:200207）药材（广州汉方现代中药研究开发有限公司提供），丹参酮ⅡA标准品（批号:110766－200314）和人参皂苷 Rg1（批号:0703－200120）对照品（中国药品生物制品检定所）;乙醇、甲醇、乙醚均为分析纯。

1.2 仪器

超声波清洗槽（槽式超声，40 kHz，功率可调）;探头式超声波处理机（25 kHz，功率可调）;双频复合超声化学反应器（自制）;本实验双频复合超声装置为探头式超声与槽式超声组合而成，25 kHz和40 kHz超声同时开启并作用于提取对象。HH－6恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）;RE－52CS旋转蒸发器（巩义市英峪予华仪器厂）;予华牌循环水真空泵（河南省巩义市英峪予华仪器厂）;UV1101紫外/可见分光光度仪（上海天美科学仪器有限公司）;JA2003电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）;日本岛津LC10ATVP型液相色谱仪。

1.3 双频复合超声操作方法

双频复合超声操作:25 kHz和40 kHz超声同时开启，40 kHz是槽式超声，连续发射超声，而25 kHz超声是探头式超声，作用5 s，停5 s，为保证40 kHz和25 kHz超声同步作用，40 kHz超声作用时间结束，25 kHz超声作用时间也结束，即同时停止超声。单频超声操作:比如40 kHz超声单频作用，实验装置与双频复合超声相同，与双频复合超声操作所不同的是:只开启40 kHz超声，而不开启25 kHz超声，目的是保持40 kHz超声产生的声场和双频复合超声中40 kHz超声产生的声场是一致。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

丹参酮ⅡA的色谱条件:仪器为waters2695/2996，色谱柱为 Hypersil ODS 5 μm，250 mm ×4.6 mm，检测波长 270 nm，流动相为水－甲醇（25∶75），柱温30℃，流速1 mL/min，分析时间 25 min，进样量 5 μL。

人参皂苷Rg1色谱条件:仪器为waters2695/2996，色谱柱为 Hypersil ODS 5 μm，250 mm ×4.6 mm，检测波长 203 nm，流动相为0.05 mol/L磷酸水溶液－乙腈（81∶19），柱温30 ℃，流速1 mL/min，分析时间 60 min，进样量 10 μL。

2.2 标准品溶液的制备

人参皂苷Rg1对照品溶液的制备:取对照品人参皂苷Rg1适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液作为对照品溶液。

丹参酮ⅡA对照品溶液的制备:对照品丹参酮ⅡA适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含16 μg的溶液作为对照品溶液。

2.3 标准曲线制备

分别精密吸取不同体积的丹参酮ⅡA对照品贮备液，用甲醇稀释调配成系列对照品溶液，分别进样5 μL，测定峰面积积分值。以丹参酮ⅡA浓度C（mg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为:Y=5.73×106x－3.62×104，r=0.999 9，丹参酮ⅡA在浓度为 0.007 4～0.222 0 mg/mL范围内线性关系良好。

分别精密吸取不同体积的人参皂苷Rg1对照品贮备液，用甲醇稀释调配成系列对照品溶液，分别进样10 μL，测定峰面积积分值。以人参皂苷Rg1浓度C（mg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为:Y=3.31×105X－4.39×104，r=0.999 7，人参皂苷 Rg1在浓度为0.080～1.620 mg/mL范围内线性关系良好。

2.4 提取率的计算

按照复方配比（丹参/三七为4∶1）准确称取丹参粉末2.0 g，三七粉末0.5 g，将丹参和三七混匀。置索氏提取器中，加乙醚80 mL，水浴上提取2 h，取出，弃去乙醚液，再加甲醇80 mL提取4 h，提取液抽滤定容，按2.3项方法测定，计算提取液有效成分的含量，并以此计算出各处理的有效成分提取率。

2.5 单频和双频复合超声提取单味药及复方中药有效成分提取率对比

根据单频超声和双频复合超声提取单方及复方工艺条件，本实验在此条件下进行，即乙醇浓度95%，物料粒径80～100目，固液比1∶15，提取时间40 min，提取温度30℃，其中药材量丹参为2 g，三七为0.5 g。结果见表1。

表1 在不同方法下提取单味药及复方中药有效成分提取率

从表1可以看出不同提取方法对单味药提取时的有效成分的提取率均低于复方提取时的提取率，对于单频和双频提取来说，整体效果更加突出，这就表明了单频，双频复合超声提取复方丹参三七的效果优于单味药提取，对于这样的结果，从整体上看可以推测有几种可能的原因:第一，当复方超声提取时，可能是因为提取了的丹参酮ⅡA成分增强了超声对人参皂苷Rg1提取的能力，或者是提取了的人参皂苷Rg1成分增强了超声对丹参酮ⅡA提取的能力;第二，中药复方有效成分比较多而且复杂，某些成分之间可能产生协同或者是互溶作用，从而导致目标成分提取率的提高。第三，由于超声的强剪切作用对复方药材粉末进一步粉碎到更细小的粒径，从而增加传质表面积，使得传质速率提高。另外，从表中可以看出，双频复合超声的提取效果又优于单频超声的提取效果，这可能由于双频复合超声产生的协同作用使得液体中的空化泡的数量增加，使得空化事件增多。另一方面，由于超声发生空化时，在极短的时间、极小的空间内可产生50 MPa以上的高压，这足以引起空化点附近的溶剂形成超临界状态，这样使得复方中的溶质在溶剂中的溶解度显著增大，导致溶质在常态下变为过饱和，从而使传质推断力变大，从而从整体上能强化传质速率。

2.6 利用统计学的方法对双频复合超声提取单方及复方丹参三七的效果进行检验

为了检验双频复合超声对复方丹参三七及单味丹参和单味三七的提取效果数据之间的差异是否因为试验过程中的测试误差或者时其他原因而导致的，我们可以利用统计学中的平均值检验方法对它们进行显著差异性检验［5］。就是检验在同样的超声条件提取下，测得的单方提取和复方提取有效成分的两组提取率是否有显著性差异，如果有两组数据有显著性差异，则说明超声提取复方和单方的效果是不一样的，否则，可以说明超声提取复方和单方的效果没有差异性，也就是复方和单方的超声提取效果没有明显的差异。

根据双频复合超声提取单方及复方工艺条件，本实验在此条件下进行，即乙醇浓度95%，物料粒径80～100目，固液比1∶15，提取时间40 min，提取温度30℃，其中药材量丹参为2 g，三七为0.5 g。每次实验重复做5次。双频复合超声提取单味丹参、三七及复方得出的丹参酮ⅡA和人参皂苷Rg1含量均用HPLC进行测定，测定结果见图1及表2。

从图1可以看出，双频复合（25 kHz/40 kHz）提取复方时的目标成分丹参酮ⅡA和人参皂苷Rg1的提取率均高于单味丹参和单味三七的目标成分。从表2可以看出，对A组和B组、C组和D组进行显著差异性检验结果可知，A组和B组、C组和D测定的结果都存在显著性差异，说明了超声提取复方丹参三七和单味药丹参及单味药三七的效果是不一样的，而且双频复合超声提取的复方丹参三七的有效成分的效果优于单味药丹参和单味药三七。通过这样的比较，我们可以知道，单味药丹参和单味药三七混合起来提取（也可以说为整提）所得的有效成分提取率高于各单味药提取（也可以说为分提），另外，由于超声提取具有低温的优点，有效成分不会发生分解，从而保持了有效成分的活性。

图1 以丹参酮ⅡA和人参皂苷Rg1为指标的单方及复方的双频复合超声提取

3 讨论

目前超声提取技术应用于中药材的提取具有很多优点，但是这些大部分只是针对单味药材的提取。中药复方是中医用方处药的一大特点，不同的药材组织结构，具有不同的最佳提取参数，而不同的有效成分，也有不同的最佳提取参数。中药复方由多味药组成，方中每味药都有可能具备不同的组织结构，且其所含有效成分多而复杂，应用超声技术能否将其最大限度的提取出来，是否也具有省时、省工、高效等优点，还需大量的实验研究表明，但这些目前尚未有公开的研究报道。本实验就是针对此问题进行的研究，但只进行了一类中药复方（复方丹参三七）的超声提取研究，研究结果表明:从提取效率方面来说，双频复合超声对复方丹参三七中的两种有效成分丹参酮ⅡA和人参皂苷Rg1的提取效果是很好的，说明了超声技术同样适用于该类复方。

从本实验可以看出，超声提取丹参酮ⅡA和人参皂苷Rg1的影响工艺参数及规律是相似的，这与它们的物理性质也许会有一定的关系，而且这些有效成分在乙醇溶剂中的溶解度都是很大的，这就有利于提取溶剂的选择，从而更有利于进行整体提取，而且也利于将复方中的有效成分尽可能的全部提取出来。另外复方中的有效成分比较多，而且复杂，针对不同的有效成分，运用单频超声要将其全部有效成分提取出来是困难的，随着超声波技术的发展，双频、多频或者可调频超声波技术为解决这一问题提供了可能。当然，复方中药本身作用机制就很复杂，而且各有效成分之间会产生互溶或者发生反应，这些因素都会对中药复方的提取有一定的影响，因此要找到超声提取技术在中药复方中的应用范围，确定其的适用性，还需要大量的中药复方超声提取研究。此外，超声技术用于中药复方的工业化大生产，是否也具可行性，更需要进一步的研究。

表2 双频复合超声提取单味药和复方丹参三七的有效成分提取率对照分析

［1］朱昌平，冯 若，陈兆华，等.双频辐照的声化学产额及其频率效应的研究［J］.南京大学学报，1998，34（1）:93－96.

［2］沈壮志，尚志远.双低频超声辐射对碘化钾溶液碘释放量影响的研究［J］.陕西师范大学学报（自然科学版），1999，27（1）:51－53.

［3］曹雁平，李建宇，朱桂清，等.绿茶茶多酚的双频超声浸取研究［J］.食品科学，2004，25（10）:139－144.

［4］徐 飞，尹蓉莉，钟 玲，等.超声提取六味地黄丸复方的工艺研究［J］. 时珍国医国药，2006，17（8）:1431－1433.

［5］邓 勃.分析测试数据的统计处理方法［M］.北京:清华大学出版社.1995:78－80.