自动电位滴定法测定金钗石斛药材中总生物碱的含量

华茉莉， 李定祥， 姜仁吉

（1.上海医药工业研究院，上海 200040;2.上海先导药业有限公司，上海 201203）

石斛为兰科石斛属植物，在我国约有70余种，主要分布在华南及西南地区，其中部分品种被收作药用，统称为石斛［1］。石斛具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳等功效，中医常将之用于治疗热病伤津，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明等病症。目前我国药用石斛的植物来源较为广泛，2005年版中国药典（一部）收载的品种包括兰科植物金钗石斛Dendrobium nobileLindl.、铁皮石斛Dendrobium candidumWall.ex Lindl.、马鞭石斛Dendrobium fimbritumHook.Var.oculatumHook.及其近似种的新鲜或干燥茎。近几十年来国内外学者对不同品种石斛开展的化学成分研究显示不同品种石斛所含化学成分差异极大［2，3］，但国家标准对石斛仅建立了性状和显微鉴别，缺少有效的、可量化的检测指标，难以实现有效的品种区分和质量控制。为此，国内许多研究者不断探索药用石斛鉴别和质量控制的有效方法［4］，甚至引入 DNA 分子标记技术［5］，但实际应用存在诸多问题。

金钗石斛作为药用石斛的主要品种之一，植物中含有大量的生物碱且多为倍半萜型结构，已分离鉴定了数十种生物碱［6］，其生物碱的含量与药材质量密切相关。由于金钗石斛中既含有脂溶性生物碱又含有水溶性的季铵型生物碱，且倍半萜型生物碱仅有较弱的紫外末端吸收，故常规色谱分析方法对其总生物碱的定量存在一定困难，以前研究者多以酸性染料分光光度法测定石斛中总生物碱的含量［7-9］，但操作繁琐、稳定性及重复性均不甚理想，测定结果误差相对较大。为此，我们尝试以自动电位滴定法测定金钗石斛药材中总生物碱的含量。

1 仪器与试剂

Metrohm 809 Titrando自动电位滴定仪;Metrohm 6.0229.100复合玻璃电极;Mettler Toledo AL204型分析天平。

石斛碱对照品，自制（熔点134.3～136.5℃，GC归一化法测定其纯度为99.5%）;高氯酸滴定液（0.1 mol/L）以2005年版中国药典一部附录ⅩⅤF项下配制并标定;732型阳离子交换树脂，上海亚东核级树脂有限公司;双蒸水、其它所用试剂均为分析纯;药材购自四川合江，经浙江省医学科学院张治国教授鉴定为兰科石斛属金钗石斛。

2 方法与结果

2.1 供试品的制备 取100 g干燥恒重的金钗石斛药材粗粉，精密称定，以10倍量90%乙醇回流提取3次，每次回流2 h，过滤，合并滤液，浓缩至无醇味，以200 mL 3%盐酸充分溶解，过滤，滤液加去离子水稀释至约400 mL，过强酸型阳离子交换树脂（树脂用量控制在200～500 mL即可），以去离子水洗至中性后，以5%氨水-50%乙醇液洗脱，以生物碱的检识反应判定洗脱终点（上样流速和洗脱流速控制在每小时流速1倍柱体积内较佳），合并氨水洗脱液，减压浓缩蒸干，即得供试品，同时称重以计算得率。

2.2 自动电位滴定法 取上述供试品0.25 g，精密称定，加冰醋酸30 mL完全溶解，将复合玻璃电极插入溶液中，选择“等速滴定MET”模式，开动搅拌器，记录pH变化，待仪器稳定后，以高氯酸滴定液（0.1 mol/L）滴定，仪器以pH值突跃自动判定滴定终点，此滴定结果以空白试验校正，滴定曲线见图2所示。

每1 mL高氯酸滴定液（0.1 mol/L）相当于26.3 mg的石斛碱（C16H25NO2），由此以石斛碱为基准物折算金钗石斛药材中所含总生物碱的百分含量。

2.3 专属性试验 自动电位滴定法测定金钗石斛药材中总生物碱含量，基本原理是在非水溶液中以强酸滴定有机碱并以pH突跃自动判定滴定终点，因此药材中非生物碱成分是否干扰滴定终点的判定是该方法是否可行的根本前提。为此，结合样品的定性鉴别及滴定曲线进行专属性试验考察，实验步骤及结果见图1、2及表1。

图1 专属性试验样品的制备

表1 金钗石斛不同提取样品的定性鉴别及电位滴定结果

综合以上试验结果，证实金钗石斛中非生物碱组分及供试品在制备过程中可能存在的氨基酸成分均不干扰滴定终点的判定，因此本测定方法具有良好的专属性。

图2 自动电位滴定曲线

2.4 线性关系考察 取同批次供试品，分别精密称定0.1、0.2、0.25、0.3、0.4 g，按2.2 项下方法测定，以供试品样品量为横坐标，以消耗的高氯酸滴定液体积数为纵坐标绘制标准曲线，进行回归分析，结果表明:供试品在0.1～0.4 g范围内，滴定液的消耗体积呈良好线性关系，线性方程y=30.78x－0.038，相关系数R=0.999 7。

2.5 精密度试验 取同批供试品，精密称定6份，按2.2项下方法操作，分别测定供试品中总生物碱含量，测定结果的RSD为0.25%，表明该方法稳定可靠。

2.6 日内稳定性试验 称取供试品约1.65 g，加冰醋酸 200 mL 完全溶解，分别于0、1、2、3、4、6 h 精密吸取30 mL待测溶液按2.2项下方法滴定，高氯酸滴定液的消耗体积数RSD为0.35%，因此表明:供试品溶液在6 h内具有良好的稳定性。

2.7 重复性试验 取同批药材6份，精密称定，按2.1项下方法制备供试品并按2.2项下方法测定，并以石斛碱为基准物折算出各份药材中总生物碱的含量，药材中总生物碱的含量测定结果 RSD为2.96%，表明该测定方法具有良好的重复性，符合含量测定的要求。

2.8 加样回收率实验 精密称取同批药材9份（与重复性试验同批药材，药材中总生物碱含量以2.7项下测得的平均值计），分别精密加入适量的石斛碱对照品溶液，按2.1项下方法制备供试品，所得供试品加30 mL冰醋酸，待完全溶解后按2.2项下方法滴定，测定各份供试品中总生物碱含量，计算回收率，测得平均回收率为96.04%（RSD为0.60%），结果见表2。

表2 加样回收率试验

2.9 样品的测定 选取从四川合江地区同一药材收购商处购得的不同批次金钗石斛药材，按2.1项下方法制备含量测定用供试品，并按2.2项下方法测定各批次药材中总生物碱的含量，结果四川合江2004年购药材，2005年购药材，2008年购药材总生物碱含量分别为0.85%、0.68%、1.03%。

从以上含量测定结果及笔者多年对金钗石斛的研究积累，金钗石斛药材中总生物碱及单一石斛碱的含量，批次间的差异明显;另外，金钗石斛俗称“黄草”，其市售品常被其它品种石斛所替代和混用，因此对主要药效成分的含量分析是药材质量控制的必要手段。

3 讨论

3.1 金钗石斛中不仅含有脂溶性生物碱，还含有水溶性的季铵型生物碱，我们实验研究证实金钗石斛醇提浓缩液的氯仿萃取层及水层对碘化铋钾检识反应均呈阳性，因此一些研究者以氯仿回流氨水浸润过的药材粗粉来制备石斛总生物碱含量测定用供试品的方法［7，8］，实际上难以达到药材中总生物碱组分的有效完全提取。

3.2 本研究中虽证实金钗石斛药材中非生物碱成分不干扰滴定终点的判定，但供试品中非生物碱成分的存在仍可能对测定结果带来系统误差，如延迟pH值突跃的反应时间，使滴定值偏高等，因此总生物碱含量测定用供试品的制备方法应保证有效提取待测成分的同时尽可能去除杂质。我们通过研究比较，以醇提酸溶与离子交换树脂方法可实现金钗石斛中不同极性生物碱组分的分离与富集，是较为理想的供试品制备方法。

3.3 采用强酸在非水溶液中滴定有机弱碱并以pH突跃自动判定滴定终点，基本实现了对金钗石斛药材中极性相差悬殊的倍半萜型生物碱的总定量，试验表明该方法简便灵敏且稳定可靠。

3.4 目前从金钗石斛中分离鉴定的生物碱多为倍半萜型骨架结构，石斛碱是其中的主要成分，以气相色谱法测得石斛碱在金钗石斛药材中最高含量可达0.18%［10］，因此本方法中以石斛碱作为基准物来折算金钗石斛中所有生物碱组分的含量，是相对可行的。

3.5 采用自动电位滴定法一定程度上解决了金钗石斛药材中总生物碱不易有效定量的难题，但该方法离精准定量尚有一定距离，因此对金钗石斛药材的质量控制，笔者建议在生物碱的薄层鉴别基础上同时建立总生物碱和石斛碱的含量测定项，即以自动电位滴定法测定总生物碱含量和以气相色谱法测定石斛碱的含量［10］，有利于全面准确地评价药材质量。

［1］白 音，包英华，金家兴，等.我国药用石斛资源调查研究［J］.中草药，2006，37（9）:附 4-6.

［2］张光浓，毕志明，王铮涛，等.石斛属植物化学成分研究进展［J］.中草药，2003，34（6）:附 5-9.

［3］陈晓梅，郭顺星.石斛属植物化学成分和药理作用的研究进展［J］.天然产物研究与开发，2000，13（1）:70-75.

［4］叶 磊，陈建真，罗小敏.石斛属药用植物质量控制研究进展［J］.江西中医药，2007，38（6）:77-78.

［5］应 依，徐 红，王铮涛.DNA分子标记技术在中药石斛类药材鉴定中的应用［J］.世界科学技术-中医药现代化，2006，8（3）:65-70.

［6］郑晓珂，曹新伟，冯卫生，等.金钗石斛的研究进展［J］.中国新药杂志，2005，14（7）:826-829.

［7］徐 宁.石斛中总生物碱的含量测定方法研究［J］.基层中药杂志，2001，15（3）:24.

［8］李亚芳，张晓华，孙国民.石斛中总生物碱和多糖的含量测定［J］.中国药事，2002，16（7）:426-428.

［9］宋锡全，王素英，李海红.滇产金钗石斛植株与细胞培养产生总生物碱含量分析［J］.贵州师范大学学报（自然科学版），2007，25（2）:1-2.

［10］华茉莉，杨 洋，沈志伟.气相色谱法测定金钗石斛药材中石斛碱的含量［J］.中药材，2006，29（4）:338-339.