解聚复肾宁对大鼠肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响

李 慧， 曹文富*， 汤为学， 陈 平

（1.重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆 400016;2.重庆医科大学病理生理教研室，重庆 400016）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最严重的微血管并发症之一，是造成终末期肾衰的主要病因。解聚复肾宁（JJFSN）是治疗DN临床疗效较好的经验方。我们以往的实验研究表明，该方对DN大鼠肾脏具有明显的保护作用［1，2］。为进一步研究 JJFSN治疗 DN的作用机制，本文探讨JJFSN对高糖环境下系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响。

1 材料

1.1 药物 JJFSN由黄芪、生地、黄连、丹参、姜黄、葛根等13味中药组成，全部中药材均购自重庆桐君阁药房，并经专家鉴定符合药典标准。1.2 动物 7周龄SD大鼠，♀♂各半，体重180～220 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证 SCXK（渝）2007－0001。

1.3 细胞 大鼠肾小球系膜细胞株HBZY－1购自中国典型培养物保藏中心。

1.4 试剂 胎牛血清（杭州四季青工程材料有限公司），MEM培养液（Hyclone公司），胰蛋白酶（GIBCO公司），四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）（Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）（Amresco公司），ColⅣ放射免疫试剂盒，Ln放射免疫试剂盒（均购自上海海研医学生物有限公司）。

1.5 仪器 CO2培养箱（Kendro Laboratory Products）;倒置显微镜（Olympus，Japan）;酶标仪（BIORAD，USA）;DFM－96型放射免疫γ计数器（合肥众成机电技术开发有限责任公司）等。

2 方法

2.1 解聚复肾宁（JJFSN）口服制剂的制备 精选黄芪、生地、黄连、葛根、丹参、姜黄等本制剂所用的全部中药材，混合水提液并浓缩成JJFSN口服制剂（每mL含生药2 g），4℃冰箱保存备用。

2.2 JJFSN含药血清的制备 16只SD大鼠，适应性喂养1周后，随机分为4组，即解聚复肾宁15、30、60 g/kg剂量组（各相当于临床成人日用药量的5、10、20 倍）和纯净水处理组。参考文献［3］，每日定时以解聚复肾宁制剂或纯净水灌胃1次，持续7 d。于末次灌胃后1 h，水合氯醛麻醉，颈动脉插管取血，4°C冰箱静置，待少量淡黄色血清析出后，离心分离血清，56 °C，30 min 水浴灭活补体，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，分别制备成含解聚复肾宁血清（简称含药血清）和正常血清，－20°C保存备用。

2.3 MTT比色法测MC增殖 选取对数生长期的MC细胞液，制备成浓度为1.5×104/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔200 μL。24 h细胞贴壁后，吸去上清，PBS清洗3次，分为以下实验组:1.正常组（NG组）:含10%正常大鼠血清的MEM培养液;2.高糖对照组（HG组）:葡萄糖25 mmol/L+含10%正常大鼠血清的MEM培养液;3.JJFSN低剂量组（LJ组）:葡萄糖25 mmol/L+含10%低剂量JJFSN大鼠血清的MEM培养液;4.JJFSN中剂量组（MJ组）:葡萄糖25 mmol/L+含10%中剂量JJFSN大鼠血清的MEM培养液;5.JJFSN高剂量组（HJ组）:葡萄糖25 mmol/L+含10%高剂量JJFSN大鼠血清的MEM培养液。每组设4个平行孔，置于37℃、5%CO2孵育箱中分别培养 12、24、48 h 后离心吸去上清液，每孔5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养4 h后，离心吸去上清，每孔加 DMSO 150 μL，自动酶标比色仪570 nm波长处检测各孔吸光度值（A）。2.4 RIA检测培养上清中ColⅣ、Ln含量 细胞处理同上，将MC细胞按每孔104接种于96孔培养板中，于37℃、5%CO2孵箱中培养48 h，收集细胞上清，按照RIA试剂盒说明书进行ColⅣ和Ln含量的测定。上清液ColⅣ和Ln数据处理拟合方式采用logit－log方程进行，根据标准曲线求出相应的蛋白含量。每组各设3个复孔，取各组平均值作为最终结果，实验重复3次。

2.5 统计学处理 采用SPSS11.0软件包进行统计分析。所有数据均用±s表示，两样本均数比较采用t检验。

3 结果

3.1 不同浓度JJFSN含药血清对MC增殖的影响

见表1。表1显示:与NG对照组比较，高糖对大鼠肾小球MC的增殖具有显著的促进作用（P＜0.05），不同浓度JJFSN含药血清作用于MC 12、24、48 h，均能显著抑制MC增殖（P＜0.05），并且该抑制效应随JJFSN含药血清浓度增加和作用时间的延长而增强。在JJFSN高剂量组作用48 h后，细胞增殖低于同一时间NG组（P＜0.05）。

表1 不同浓度JJFSN作用12 h、24 h及48 hMC增殖比较（A值，x ± s，n=4）

3.2 JJFSN对MC细胞外基质分泌的影响

见表2。RIA结果显示，高糖可以促进MC ColⅣ和Ln分泌（P＜0.05）。JJFSN含药血清作用48 h后，MC培养上清中ColⅣ和Ln含量明显减低（P＜0.05），并且这种作用随着药物浓度的增加而增强。

表2 不同浓度JJFSN含药血清作用48 h对ColⅣ以及Ln分泌的影响（ng/mL，±s）

表2 不同浓度JJFSN含药血清作用48 h对ColⅣ以及Ln分泌的影响（ng/mL，±s）

与NG组比较，*P＜0.05;与HG组比较，#P＜0.05。

组 别NG组 HG组 LJ组 MJ组 HJ组ColⅣ 42.38±1.64 70.63±4.39* 56.36±2.78# 49.33±2.69# 41.39±2.05#Ln 51.80±4.33 80.29±3.95* 64.56±4.09# 55.61±3.53# 50.42±4.73#

4 讨论

DN是糖尿病最主要的并发症之一，是终末期肾衰的主要原因［4］。高糖为DN病情进展的一个主要危险因素，既往研究认为，高糖作用早期（48 h内），可以促进MC增殖，作用后期（48 h后）则可导致MC凋亡［5］。本实验将25 mmol/L高糖作用于MC，并于12、24、48 h观察JJFSN含药血清对MC增殖的影响。结果表明:经高糖刺激后，MC增殖活性明显增强，与文献报道一致。此外，不同浓度JJFSN含药血清均能抑制高糖诱导的MC增殖，且作用具有时间、剂量依赖关系。JJFSN高剂量组作用48 h后，细胞增殖明显低于同一时间NG组。

除了影响MC增殖外，高糖还可以导致血液流变学改变，血管通透性增加，以及ECM的增多与沉积［6，7］。本研究着重观察了JJFSN作用48h后，细胞培养上清中ColⅣ和Ln含量的变化。实验结果表明:JJFSN可逆转高糖对MC ColⅣ 和Ln分泌的促进作用，显著降低MC培养上清中ColⅣ和Ln的含量。

DN临床辨证，以气阴两虚、瘀毒痰凝证型最为常见。解聚复肾宁是治疗DN的有效经验方，具有益气养阴、解毒活血等作用。方中以黄芪益气，生地养阴，黄连清热解毒，葛根、姜黄活血通络。临床研究表明，黄芪可通过减少24h蛋白尿，尿白蛋白，以及改善餐后血糖和脂质代谢，缓解DN病情［8］。亦有体外实验说明其提取物对MC增殖具有良性双向调节作用［9］。黄连可降低早期糖尿病肾病大鼠肾组织VEGF蛋白和mRNA的表达［10］。方中其他药物的单方或复方，在体内及体外研究中亦有类似作用［11，12］。

本研究第一次观察到了JJFSN对高糖引起的系膜细胞增殖以及细胞外基质分泌的抑制作用，为JJFSN用于临床治疗DN，防治早期肾小球硬化提供了新的依据。

［1］焦颖华，曹文富，陈安凤，等.解聚复肾宁对糖尿病鼠肾CTGF、FN表达及肾保护作用研究［J］.中国老年学杂志，2008，28（12）:1049－1051.

［2］陈益山，曹文富，焦颖华.解聚复肾宁对糖尿病大鼠肾脏PDGF－B 和 BMP－7 的影响［J］.中药新药与临床药理，2009，20（1）:26－29.

［3］高 冬，宋 军，陈可冀，等.血府逐瘀汤影响小鼠骨髓造血干细胞的实验研究［J］.中国中西医结合杂志，2007，27（6）:527－530.

［4］Locatelli F，Canaud B，Eckardt KU，et al.The importance of diabetic nephropathy in current nephrological practice［J］.Nephrol Dial Transplant，2003，18（9）:1716－1725.

［5］Wolf G.Molecular mechanisms of diabetic mesangial cell hypertrophy:a proliferation of novel factors［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13（10）:2611－2613.

［6］Molitch ME.The relationship between glucose control and the development of diabetic nephropathy in type I diabetes［J］.Semin Nephrol，1997，17（2）:101－113.

［7］Phillips CA，Molitch ME.The relationship between glucosecontrol and the development and progression of diabetic nephropathy［J］.Curr Diab Rep，2002，2（6）:523－529.

［8］赵学兰，林松娟，张琳琳，等.黄芪当归合剂治疗糖尿病肾病的临床观察［J］.中成药，2007，29（5）:642－644.

［9］房信胜，穆象山，周英红，等.黄芪皂苷和黄芪多糖对大鼠肾脏系膜细胞增殖的影响［J］.时珍国医国药，2008，19（6）:1448－1449.

［10］魏 瑜，刘 圣，唐丽琴，等.复方黄连胶囊对早期糖尿病肾病大鼠肾组织VEGF蛋白和mRNA表达的影响研究［J］.中国药房，2008，19（12）:902－905.

［11］于冬青，刘金波，邓华聪.姜黄素对糖尿病大鼠肾脏保护作用的实验研究［J］.中国糖尿病杂志，2009，17（7）:549－551.

［12］孙万森，王 竹，王 娟，等.祛风通络方对大鼠肾小球系膜细胞增殖及转化生长因子β1和白细胞介素6 mRNA表达的影响［J］.中西医结合学报，2008，6（9）:915－920.