炮制对荷叶中荷叶碱和槲皮素含量的影响

董春永， 张学兰， 李慧芬

（山东中医药大学，山东济南 250355）

荷叶为睡莲科植物莲Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥叶，具有清热解暑，升发清阳，凉血止血的功效［1］。现代对荷叶的炮制方法主要有煅炭［1］和炒炭［2］两种。研究表明，荷叶中主要含有生物碱、黄酮类、有机酸等成分。生物碱类成分有荷叶碱、原荷叶碱、N－去甲荷叶碱、莲碱等;黄酮类成分有金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、莲苷等;有机酸类成分有酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸等［3，4］。炮制对荷叶中荷叶碱和槲皮素含量有何影响，尚未见报道。本研究以荷叶碱和槲皮素含量为指标，对荷叶生品、煅炭品及炒炭品进行比较，为探讨荷叶的炮制机理、筛选优化荷叶饮片的炮制工艺，提供实验依据。

1 仪器和试药

Agilent1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）;FA1604N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）;PM PLUS型红外测温仪（美国 Raytek公司）;多星电炒锅（淄博多星电器集团有限责任公司）。

荷叶购自济南市建联中药店，经本校周凤琴教授鉴定为睡莲科植物莲Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥叶经加工而成的丝状片，产地山东。煅荷叶炭:按《中国药典》2005年版一部荷叶项下方法依法炮制［1］。取净荷叶丝50 g，置电炒锅内，密封，230 ℃煅制3 h，放凉，取出。成品表面乌黑色。炒荷叶炭:按《山东省中药炮制规范》2002年版荷叶项下方法依法炮制［2］。取净荷叶丝50 g，置电炒锅内，280℃（用红外测温仪测定锅底温度）炒制5 min，取出，放凉。成品表面乌黑色。荷叶碱、槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号为111566－200402、100081－200406）;高效液相用乙腈、甲醇（色谱纯）;其余试剂均为A.R。

2 方法与结果

2.1 水分含量测定 取各样品粗粉约2 g，精密称定，按《中国药典》2005年版一部附录Ⅸ H水分测定法（烘干法）测定（n=3），结果生荷叶、煅荷叶炭及炒荷叶炭的水分含量依次为10.44%、4.31%、4.21%。按干燥品计算样品中各指标成分的含量。

2.2 荷叶碱含量测定［1］

2.2.1 供试品溶液的制备 取各样品粗粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流2.5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.2.2 对照品溶液制备 取荷叶碱对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成浓度为1.355 mg/mL的溶液，摇匀，即得。

2.2.3 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18，200 mm×4.6 mm;流动相∶乙腈－水－三乙胺－冰醋酸（27∶70.6∶1.6∶0.78）;流速:1 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:270 nm。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取荷叶碱对照品溶液0.1、0.5、1、2、3 mL，分别置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。各取20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作线性回归，结果荷叶碱在 2.71 μg/mL ～81.30 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=67.02X+21.26，r=0.999 9。

2.2.5 精密度试验 取生荷叶供试品溶液，连续进样6次，结果6次测得荷叶碱峰面积的 RSD为1.22%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取生荷叶供试品溶液，在室温下自然放置，分别在 0、2、4、6、8、12 h 进行测定，结果6次测得荷叶碱峰面积的RSD为1.32%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取生荷叶样品，平行6份，按供试品溶液制备方法制备并测定，结果6次测得荷叶碱含量的RSD为1.38%。表明测定方法重复性良好。

2.2.8 样品含量测定 取各样品粗粉，按2.2.1项下方法分别制得供试品溶液，分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，记录荷叶碱峰面积，分别代入回归方程计算荷叶碱含量，色谱图见图1，结果见表1。

图1 荷叶碱对照品（A）、荷叶生品（B）、荷叶煅炭品（C）、荷叶炒炭品（D）HPLC图

表1 荷叶不同炮制品中荷叶碱和槲皮素含量比较（n=3）

2.2.9 加样回收率试验 取已测知荷叶碱含量的生荷叶粗粉共6份，每份约0.25 g，精密称定，分别精密加入荷叶碱对照品溶液（0.271 mg/mL）5 mL，按2.2.1项下方法制得供试品溶液，分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，记录荷叶碱峰面积，计算含量和回收率，结果其平均回收率为99.57%，RSD为1.13%。

2.3 槲皮素含量测定［5］

2.3.1 供试品溶液制备 取各样品粗粉约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.3.2 对照品溶液制备 取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成浓度为1.000 mg/mL的溶液，摇匀，即得。

2.3.3 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18;200 mm×4.6 mm;流动相∶甲醇－0.2%磷酸溶液（55∶45）;流速:1 mL/min;柱温:30℃;检测波长:360 nm。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取荷叶碱对照品溶液0.1、0.5、1、2、3 mL，分别置5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。各取20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作线性回归，结果槲皮素在0.02 mg/mL～0.6 mg/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=10 116X+23.717，r=0.999 9。

2.3.5 精密度试验 取炒荷叶炭供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果6次测得荷叶碱平均峰面积的RSD为1.34%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取炒荷叶炭供试品溶液，在室温下避光自然放置，分别在 0、2、4、6、8、12 h 进行测定，结果荷叶碱平均峰面积的RSD为1.12%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.7 重复性试验 取炒荷叶炭样品，平行6份，按供试品溶液制备方法制备并测定，结果荷叶碱平均含量的RSD为1.31%。表明测定方法重复性良好。

2.3.8 样品含量测定 取各样品粗粉，按2.3.1项下方法分别制得供试品溶液，分别精密吸取20μL，注入液相色谱仪，记录槲皮素峰面积，分别代入回归方程计算槲皮素含量，色谱图见图2，结果见表1。

图2 槲皮素对照品（A）、荷叶生品（B）、荷叶煅炭品（C）、荷叶炒炭品（D）HPLC图

2.3.9 加样回收率试验 取已测知含量的炒荷叶炭粗粉，共6份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入槲皮素对照品溶液（6.75 mg/mL）1 mL，按2.3.1项下方法制得供试品溶液，分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，记录槲皮素峰面积，计算含量和回收率，结果其平均回收率为98.69%，RSD为1.23%。

3 小结和讨论

3.1 测定了荷叶生品、煅炭品和炒炭品中荷叶碱和槲皮素含量，结果表明，荷叶经煅炭或炒炭后，荷叶碱损失殆尽，而槲皮素含量较生品增加6倍多。说明加热炮制对荷叶中荷叶碱和槲皮素含量有显著影响。本研究结果为荷叶饮片的炮制和质量控制提供了实验依据。

3.2 荷叶碱的熔点较低为165℃，荷叶制炭后荷叶碱含量大幅度降低分析是由于经高温加热使荷叶碱受热破坏所致。荷叶中槲皮素多以结合苷的形式存在［6］，荷叶中的金丝桃苷、异槲皮苷的熔点依次为197～199℃和198～200℃，二者的苷元均为槲皮素，荷叶制炭后槲皮素含量显著升高，分析可能与金丝桃苷和异槲皮苷受热后分解生成槲皮素有关，对此有待进一步深入研究。

3.3 传统认为，生荷叶长于清热解暑、升发清阳，制炭后可增强其止血作用［7］。药理研究表明，荷叶碱可明显降低小鼠血清中甘油三酯和胆固醇的含量［8］，槲皮素对二磷酸腺苷、胶原、钙离子载体和花生四烯酸等诱导剂引起的人血小板聚集反应有显著的抑制作用［9］。荷叶制炭后止血作用增强分析与槲皮素含量增加有关，而荷叶制炭后荷叶碱含量降低与其止血作用增强有何关系有待进一步研究探讨。

［1］中国药典［S］.一部.2005:195.

［2］山东省药品监督管理局·山东省中药炮制规范［M］.济南:山东友谊出版社，2002:336.

［3］刘淑萍，樊淑彦，侯海妮，等.荷叶化学成分及药理作用研究进展［J］.河北医科大学学报，2003，25（4）:254－256.

［4］田 娜，刘仲华，黄建安，等.高效制备液相色谱法从荷叶中分离制备黄酮类化合物［J］.色谱，2007，25（1）:88－92.

［5］雍国新.荷叶中槲皮素提取工艺研究［J］.安徽农业科学，2008，36（14）:5705－5706.

［6］邬晓鸥，熊 英.荷叶质量标准研究［J］.现代中药研究与实践，2004，18（4）:27－29.

［7］原思通.医用中药饮片学［M］.北京:人民卫生出版社，2001:198.

［8］林木仙，林国荣，陈剑锋，等.高纯度荷叶碱的制备及其药效研究［J］.福州大学学报，2008，36（2）:303－308.

［9］顾振纶，钱曾年，肖 东，等.槲皮素对血小板的抑制作用及其机理分析［J］.苏州医学院学报，1991，11（4）:262－265.