神经激肽1受体拮抗剂WIN62577对大鼠气道平滑肌细胞增殖和迁移的影响

李淼，尚云晓，相云

（中国医科大学 附属盛京医院小儿呼吸内科，沈阳 110004）

神经激肽 1受体（neurokinin-1 receptor，NK-1R）是感觉神经肽P物质的受体，P物质通过NK-1R起作用，其效应包括气道收缩、血管扩张和血浆渗出、增加微血管渗透性。P物质及其受体在哮喘气道表达增高，参与哮喘的发病机制。P物质受体拮抗剂已被广泛应用于临床，大多应用于临床减轻疼痛、抗抑郁治疗、抑制皮炎。P物质受体拮抗剂对于气道炎症的作用处于试验阶段，有实验证明NK-1R特异性的受体拮抗剂静脉注射可以减轻由于吸烟导致的肺损伤和香烟导致的气道炎症［1］，也有研究证明NK-1R拮抗剂可以减轻机械通气引起的细胞因子增高的不良反应［2］。气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cell，ASMC）是气道内的效应细胞，受气道内各种因素，尤其是各类免疫细胞释放的细胞因子和炎性介质的调节，产生相应的收缩反应，调节气道的口径，从而影响呼吸功能。在持续哮喘的病例中，在细胞外基质的影响和各种细胞因子、炎性因子和生长因子的作用下，ASMC会出现增殖和迁移性生长的现象。白细胞介素 13（interleukin-13，IL-13）对 ASMC 有促进增殖的作用。因此，本研究通过IL-13诱导ASMC增殖后给予NK-1R拮抗剂WIN62577，观察WIN62577对大鼠ASMC生长曲线及细胞周期的影响，试图说明WIN62577对ASMC增殖的作用；并通过Transwell小室方法研究WIN62577对大鼠ASMC迁移的作用，试图探讨WIN62577对哮喘大鼠气道的作用，为哮喘的治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

雌性Wistar大鼠，6~8周龄，体质量150~160 g，共15只，中国医科大学中心实验室动物部提供；饲养期间给予正常饮食，饲养条件一致。DMEM培养基、胎牛血清，购自美国Hyclone公司；抗α平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，购自武汉博士德公司；MTT、胰蛋白酶、NK-1R拮抗剂WIN62577，购自美国Sigma公司；FITC山羊抗兔荧光二抗、Ⅳ型胶原酶，购自美国GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ASMC原代培养：参照文献［3］，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（30 mg/kg）麻醉后，左心室取血处死。无菌分离大鼠气管，仔细剥离外膜，去除内膜。将气管平滑肌剪下，用含双抗的DMEM培养液清洗后，将组织剪碎用0.1%的Ⅳ型胶原酶于37℃水浴下消化30 min两次，待液体浑浊时用含10%胎牛血清的DMEM终止消化。1 000 r/min离心后用含10%胎牛血清DMEM重悬，200目滤网过滤后37℃、5%CO2孵育箱培养。3 d换液，7 d长满培养瓶。用0.25%胰蛋白酶消化传代后，利用成纤维细胞贴壁较快的特点纯化ASMC，取第4代细胞用于检测。

1.2.2 ASMC的鉴定：倒置显微镜下观察，ASMC呈梭形或多角型，呈谷峰样改变。以抗α平滑肌肌动蛋白单克隆抗体进行免疫荧光FITC染色鉴定，胞浆呈绿色荧光的细胞为平滑肌细胞。阴性对照组用PBS代替抗α平滑肌肌动蛋白单克隆抗体。荧光倒置显微镜（IX51，日本OLYMPUS公司）下观察照相。

1.2.3 MTT比色法分析WIN62577对IL-13诱导的大鼠ASMC增殖的影响：按照随机分组的原则将第4代ASMC分为空白对照组、IL-13干预组和WIN62577+IL-13干预组。IL-13干预组用含IL-13（1×10-5g/L）的 DMEM 培养液干预；WIN62577+IL-13干预组用含 IL-13（1×10-5g/L）及 WIN62577（1×10-8g/L）的DMEM培养液干预；空白对照组用PBS代替IL-13及WIN62577。将处于对数生长期的第4代ASMC以2×104/ml的密度接种于96孔板，先用无血清的DMEM培养液培养24 h达到同步化。给予干预因素24、48和72 h后，每孔加MTT溶液（5 mg/ml）20 μl，继续孵育 4 h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加150μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。酶联免疫监测仪490 nm波长测定各孔吸光度值，记录结果，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制细胞生长曲线。每组加5个复孔，实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测WIN62577对大鼠ASMC细胞周期的影响：实验分组同MTT比色法。将处于对数生长期的第4代ASMC调整为每瓶2×106/ml的密度，先用无血清的DMEM培养液培养24 h达到同步化。给予干预因素24 h后，0.25%胰酶消化收集细胞，70%乙醇固定过夜，给予RNA酶50 mg/L及溴化乙锭100 mg/L，4℃避光30 min检测。计算G1、S和G2期细胞的比例。实验重复3次。

1.2.5 Transwell小室检测WIN62577对ASMC迁移的作用：用正常大鼠5只原代培养第4代ASMC，当ASMC生长至80%融合时，用0.25%的胰酶消化细胞，用含10%胎牛血清的DMEM以1×105/ml密度重悬细胞，下室加入含 WIN62577（1×10-8g/L）和 10%胎牛血清的DMEM培养液600μl，上室加入细胞悬液100μ1，将小室置于37℃孵育箱，24 h后取出小室，小心取出滤膜，棉签轻轻擦去微孔膜朝上一面未穿膜的细胞。膜下面的ASMC用4%多聚甲醛固定20 min，苏木素染色10 min，二甲苯透明1 min，中性树胶封片，倒置显微镜（×400）下随机计数5个视野的细胞数，取均值。每次5个复孔，实验重复3次。空白对照组给予相同剂量的PBS代替WIN62577。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。实验结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫荧光鉴定ASMC

当细胞长至融合状态呈峰谷改变时进行传代，用第4代ASMC作为实验对象。用兔抗大鼠αactin、山羊抗兔FITC免疫荧光二抗染色鉴定ASMC，胞浆呈绿色荧光着色的细胞为ASMC。见图1。

2.2 WIN62577对IL-13诱导的大鼠ASMC增殖的影响

IL-13干预组ASMC增殖较空白对照组ASMC明显，24 h开始增殖，48 h达高峰，48和72 h两组比较差异有统计学意义（P<0.05）；WIN62577+IL-13干预组与IL-13干预组及空白对照组比较，48及72 h ASMC增殖的差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.3 WIN62577对大鼠ASMC细胞周期的影响

WIN62577+IL-13干预组ASMC各细胞周期的细胞比例分别为 G1期（85.0±2.5）%、S期（4.5±3.7）%、G2期（9.5±1.4）%，IL-13 干预组为 G1期（80.2±6.2）%、S 期（6.9±2.1）%、G2期（12.9±5.2）%，空白对照组为 G1期（75.2±5.2）%、S期（8.6±2.8）%、G2期（16.2±3.4）%。WIN62577+IL-13干预组 ASMC 大多停留于G1期，与IL-13干预组及空白对照组相比各期细胞比例的差异均有统计学意义（P均<0.05）。

2.4 Transwell小室分析WIN62577对ASMC迁移的作用

正常 ASMC 24 h 迁移细胞数为（23±3）/HP；加入WIN62577干预后ASMC迁移数为（16±2）/HP，与正常ASMC比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

3 讨论

哮喘是由多种细胞及其细胞组分参与的慢性气道炎症，气道重塑是哮喘的重要特征。哮喘气道重塑的病理特点包括平滑肌细胞增生、肥大、气道上皮下纤维化、黏液化生、细胞间质的重塑及血管增多等。哮喘时ASMC是很重要的效应细胞，在多种细胞分泌的细胞因子、炎性介质的作用下尤其在哮喘气道重塑时，ASMC产生收缩、增殖、迁移等生物学效应。

IL-4和IL-13是TH2淋巴细胞释放的主要的促炎因子［4］，在气道疾病的发生发展中起到重要的作用。这两种细胞因子改变气道的完整性，导致气道对各种刺激的反应敏感性增加［5］。有学者通过动物实验证明IL-13基因敲除小鼠发生气道高反应性和气道重塑的几率减小，可见IL-13在哮喘气道高反应性和气道重塑中起到重要作用［6］。增加平滑肌细胞的体积或改变平滑肌细胞的收缩特性都可以改变气道的反应性［7］。有研究报道，IL-13可以直接作用于平滑肌细胞增加乙酰胆碱对气道的高反应性［8］。由此可见，IL-13对气道平滑肌细胞的作用在哮喘的发生发展中起到重要的作用。IL-13可以促进ASMC增殖，参与气道重塑［9］，因此，本研究通过MTT及流式细胞仪分析证明NK-1R拮抗剂有抑制IL-13介导的ASMC增殖的作用。MTT实验证明WIN62577对ASMC增殖的抑制作用从24 h开始，48 h达高峰。流式细胞仪分析提示ASMC细胞在给予WIN62577后大多停留于G1期。细胞周期有两个关键的调定点，包括G1/S、G2/M的转换。WIN62577将ASMC调定于G1期，G1期关系到整个细胞周期的启动，而G1期向S期转变的关键是细胞周期蛋白D。因此，NK-1R拮抗剂对细胞周期蛋白D及其他调控基因的作用有待进一步研究。另外，IL-13的生物活性是通过与细胞表面相应的IL-13受体结合，从而激活细胞内蛋白质酪氨酸而完成的，而P物质是通过与其特异性NK-1R结合后，通过G蛋白与第二信使磷脂酸肌醇二磷酸相联系，并通过三磷酸肌醇作用于膜上的钙离子通道，引起膜电位的去极化和蛋白激酶活性改变而发挥作用的［10］。NK-1R拮抗剂通过什么途径抑制IL-13诱导的细胞增殖有待进一步研究。

哮喘时嗜酸性粒细胞、肥大细胞等多种细胞分泌细胞因子及炎性因子参与哮喘的发生发展。有学者通过实验证明P物质对哮喘患者嗜酸性粒细胞有活化和趋化作用［11］，本研究通过Transwell小室实验证明WIN62577有抑制平滑肌细胞迁移的作用。

综上所述，WIN62577有抑制ASMC增殖和迁移的作用，为治疗哮喘新药的开发提供理论依据。

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