IGF-1在人非小细胞肺癌细胞增殖中的作用

孙秀华，胡海洋，张洪开，解智慧，于爱鸣

（中国医科大学 生物化学与分子生物学教研室，沈阳 110001）

肺癌是目前世界上死亡率较高的恶性肿瘤之一，其发病率仍在逐年上升［1］。近年研究发现，胰岛素样生长因子 1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）与肿瘤的发生、发展密切相关，具有调控细胞增殖和抗细胞凋亡的作用［2］。本研究通过在肺肿瘤细胞中加入不同浓度外源性IGF-1后，观察细胞周期、增殖变化，探讨IGF-1对人非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）A549、LK2、H460 细胞系增殖的影响及可能存在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

肺腺癌A549、鳞癌LK2、大细胞肺癌H460细胞系购自中国科学院细胞库，RPMI 1640、DMEM培养基购自美国Gibco公司，IGF-1购自PeproTech公司，以DMSO溶解，SKP2抗体购自Bioworld公司，CDC20 同源蛋白 1（CDC20 homolog1，CDH1）抗体购自Santa Cruz公司，MTT、PI购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：H460细胞系用含10%胎牛血清的1640培养基，A549、LK2细胞系用含10%胎牛血清的DMEM培养基，均置于饱和湿度，37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 MTT法检测IGF-1对细胞增殖的影响：取单细胞悬液，以4×103/孔细胞接种于96孔板。培养24 h后，血清饥饿24 h，细胞分为处理组和对照组，处理组分别给 0.1，1，10，100 ng/ml的 IGF-1，以 DMSO组为对照组，每组6个复孔，继续培养24 h后，加入20μlMTT溶液，37℃孵育4 h，DMSO振荡溶解，选择490 nm为吸收波长，酶标仪测各孔吸光度。增值率=（A实验组-A对照组）/A对照组×100%

1.2.3 流式细胞术（flow cytometer，FCM）检测细胞周期：细胞接种于6孔板，5%CO2培养箱中培养24 h后（细胞汇合度为60%左右）血清饥饿24 h，按上述分组，处理组加1 ng/ml IGF-1，对照组加等量DMSO，继续培养24 h后，胰酶消化，取单细胞悬液，70%乙醇溶液冰上固定2 h，PBS洗涤2次，加入PI染液（50 μg/ml PI，1 mg/mlRNase），室温，避光孵育30 min，流式细胞仪检测。

1.2.4 Western blot检测细胞中SKP2和CDH1的蛋白表达：细胞接种于6孔板，5%CO2培养箱中培养24 h后（细胞汇合度为60%左右），血清饥饿24 h，按上述分组，处理组加1 ng/ml IGF-1，对照组加等量DMSO，继续培养24 h，收集细胞，加裂解液冰上裂解30 min，超声破碎，4℃，12 000 r/min离心10 min后取上清，考马斯亮蓝法蛋白定量，调整样品浓度使其相同，蛋白经SDS-PAGE后，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗过夜，经洗涤后，再加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h，ECL显影并扫描测灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS12.0软件进行统计分析，各组数据以x±s表示，均值比较用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 IGF-1在非小细胞肺癌 A549、LK2、H460细胞增殖中的作用

MTT 结果显示，与对照组相比，0.1，1，10，100 ng/ml IGF-1均显示有促进非小细胞肺癌A549、LK2、H460细胞增殖的作用（P<0.05），其中，1 ng/ml IGF-1作用后细胞增殖率达到峰值，10，100 ng/ml时细胞增殖率下降，见表1。

表1 不同浓度IGF-1对A549、LK2、H460细胞增殖影响（x±s）Tab.1 The effect of IGF-1 on the proliferation of A549，LK2 and H460 cells（x ±s）

2.2 IGF-1对细胞周期进程的影响

FCM结果显示，与对照组相比，非小细胞肺癌A549、LK2、H460 3种处理组细胞S期细胞均明显增加（A549：t=31.29；LK2：t=26.88；H460：t=72.67），而 G1期细胞则较对照组减少（A549：t=19.76；LK2：t=50.77；H460：t=31.38），差异有统计学意义（P<0.01），表明 IGF-1促进非小细胞肺癌 A549、LK2、H460细胞G1/S期进程，见图1。

表2 IGF-1处理前后A549、LK2、H460细胞中SKP2、CDH1蛋白表达Tab.2 The expression of SKP2 and CDH1 protein in A549，LK2 and H460 cells treated with IGF-1

2.3 IGF-1对SKP2蛋白、CDH1蛋白表达影响

生长至60%汇合度的细胞经IGF-1处理24 h后，与对照组相比，处理组SKP2蛋白表达明显增加（A549：t=5.789；LK2：t=6.0859，H460：t=7.349），差异有统计学意义（P<0.05）。CDH1蛋白无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），见图2、表2。

3 讨论

细胞的过度增殖是肿瘤发生与发展的重要原因。因此，研究肿瘤细胞增殖的分子机制对于研制抗癌药物、抑制肿瘤发展、提高患者生存率是至关重要的。IGF-1是胰岛素样生长因子家族中的成员，其分子结构与胰岛素相似，是一个非糖基化的、由70个氨基酸残基组成的蛋白质，是一种细胞增殖调控因子，已被证实为肿瘤细胞增殖的诱导剂。然而，IGF-1对肺癌细胞增殖的影响及可能机制的研究报道较少，尚未取得一致性结论［3］。

SKP2是SCF型泛素连接酶的靶蛋白识别组分，主要识别包括p27、p21等细胞周期调节蛋白，促进细胞周期G1/S期转换，调控细胞周期进程，被认为是癌蛋白，目前已成为分子肿瘤学研究中的热点［4］。

本研究采用MTT法检测不同浓度IGF-1对NSCLC细胞增殖的影响，结果显示细胞增殖率增加并非完全呈剂量依赖性，1 ng/ml IGF-1作用最强，细胞增殖率最大，10 ng/ml IGF-1作用时，细胞增殖率下降，100 ng/ml IGF-1作用时，细胞增殖率趋于恒定。IGF-1的促增殖作用以及IGF-1与IGF-1受体结合的有效性受胰岛素样生长因子结合蛋白（IGF-binding protein，IGFBP）的调节，因此，IGF-1 的作用效果不仅与其自身表达有关，而且还与IGF-1受体以及IGFBP的表达和活性有关，IGFBP通过改变其自身与IGF-1的亲和力，来调节IGF-1与IGF-1受体结合的数量，从而影响着IGF-1的作用效果［5］。高浓度IGF-1引起细胞增殖率的下降可能与IGF-1受体的降调节、IGFBP的反馈调节有关。本研究结果显示，IGF-1处理的肺癌细胞表现为S期细胞明显增多，而G1期细胞减少，提示IGF-1可促进NSCLC细胞G1/S期转换而加速细胞周期进程，导致肺癌细胞快速增殖及恶性发展。

Western blot结果显示3种肺癌细胞SKP2蛋白表达水平均明显升高。IGF-1与IGF-1受体结合后，激活PI3K/Akt信号转导通路和MAPK信号转导通路，引起细胞生长增殖和存活。前期实验结果表明，PI3K抑制剂LY294002可通过SKP2-p27轴抑制PI3K/Akt信号通路［6］。因此可以认为，IGF-1通过PI3K/Akt信号转导通路增加SKP2蛋白的表达水平，进而减弱p27、p21的细胞周期的抑制作用，导致细胞异常增殖。

最新的研究发现，作为调控细胞周期的主要泛素连接酶E3 APC/CDH1能够作用于SKP2蛋白，将其泛素化并经由蛋白酶体降解，使细胞停留在G1期，防止未成熟细胞过早进入 S 期［7］。Fujita等［8］在乳腺癌细胞的研究中证实，敲除CDH1基因能够促进乳腺癌细胞生长，并且CDH1是通过Skp2-p27轴调节细胞周期进程，抑制肿瘤细胞的生长。Liu等［9］根据在胃肠道肿瘤中的相关研究结果也作了类似报道，本研究结果显示，非小细胞肺癌细胞中加入IGF-1后，CDH1蛋白表达水平没有显著性变化。因此，可推测IGF-1介导的SKP2蛋白表达水平增加似乎与CDH1蛋白由细胞核向细胞质转位有关，其确切的分子机制有待于今后进一步深入研究。

综上，在 IGF-1 的作用下，A549、LK2、H460 3 种非小细胞肺癌细胞中的SKP2蛋白的表达增强，S期细胞明显增多，而CDH1蛋白的表达水平没有显著性变化。这些实验结果表明，IGF-1主要通过促进细胞周期G1/S期转换，加速细胞周期进程，参与肺癌的发生与发展。随着有关肺癌的发生发展的分子机制的广泛研究，必将为研发抗肿瘤药物及肿瘤治疗提供新的思路。

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