银杏叶提取物对2型糖尿病大鼠膈肌收缩能力的影响*

李旭升，傅永强，周 标，胡 野，陈国荣

(1.金华职业技术学院医学院，浙江 金华 321017;2.温州医学院病理学教研室，浙江 温州 325000)

骨骼肌是胰岛素刺激状态下葡萄糖摄取的主要部位，也是糖尿病损害的主要靶位。膈肌作为重要的呼吸肌，具有终身持续收缩特性，对于维持生物体的肺功能具有极其重要的作用[1]。我们前期的研究发现银杏叶提取物(ginkgo biloba extract，GbE)可减轻自由基和过量一氧化氮对1型糖尿病大鼠膈肌的损伤[2]。本研究旨在探讨GbE对2型糖尿病大鼠膈肌收缩能力和能量代谢酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验用药及试剂

GbE购自北京双鹤天然药物有限公司(舒血宁注射液，批号319163.0606)，每支装 5 ml，折合GbE为17.5 mg(含总黄酮醇苷4.2 mg;含银杏内酯0.70mg)。链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司，临用前溶解于0.1 mmol/L枸椽酸缓冲液内，pH=4.0。细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，CCO)、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物及实验方案

雄性清洁级SD大鼠40只，体重(180～250)g，由温州医学院实验动物中心提供。按随机数字表法分为正常对照组10只、造模组30只。正常组喂以普通饲料，造模组喂以高糖高脂饲料(饲料组成:10.0%猪油，20.0%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐，66.5%常规饲料)，整个实验期间自由进食、进水。4周后，造模组在禁食16 h后按25 mg/kg腹腔注射链脲佐菌素，对照组腹腔注射等容积枸椽酸缓冲液。72 h后尾静脉采血用血糖仪(one TouchⅡ型，强生中国有限公司)测定尾静脉全血血糖，≥13.8 mmol/L为模型成功。随机选取造模成功大鼠20只平均分成2组:糖尿病组、GbE治疗组。GbE治疗组按8 mg/(kg◦d)剂量腹腔注射GbE，对照组及糖尿病组腹腔注射等容积生理盐水，每天1次，连续8周。

1.3 膈肌收缩能力测定

在戊巴比妥腹腔注射麻醉下，迅速剖开腹腔，取左侧肋膈肌(包括中心腱及部分肋骨)，置于盛有Krebs氏液的平皿中，持续通入 95%O2和5%CO2的混合气体，依肌纤维走行方向修剪成宽约0.8 cm的肌条待用。参照Coombes和沈兴平等[3，4]的检测方法，将膈肌条垂直悬挂于盛满37℃Krebs氏液(95%O2，5%CO2)的麦氏浴槽中。肋骨端固定在浴槽底部，中心腱端连接于张力换能器(贝科监控仪器有限公司)。调节肌肉至最适初长度(L0)，静置稳定20min，两个铂金丝电极置肌条两边，电子刺激器以超最大电压(约20V)刺激膈肌。张力换能器的输出信号由智能八道生理记录仪记录分析。测定下列参数:

(1)单收缩张力(Pt):每根肌条测定两次在L0时的Pt，每次刺激(强度20.00V，波宽2 ms)间隔2 min。以两次平均值作为测定值，用肌肉横截面积(cross-sectional area，CSA)校正(单位:kg/cm2)[4]。

(2)最大强直张力(P0):在单收缩刺激后静置10min ，肌条予 100Hz，20.00V ，波宽 2 ms，串长 400ms刺激，测定P0，其值由CSA校正(单位:kg/cm2)。

(3)疲劳指数(FI):予肌条20.00V，波宽2 ms，每分钟30串，每串5波，每波5 Hz，串间隔1 s，总刺激10min，致膈肌疲劳，2 min后测疲劳后张力，取2次平均值为测定值，将其与Pt之比作为FI值。

1.4 膈肌能量代谢酶活性测定

制备肌条同时取部分膈肌，秤重剪碎，以1∶10(质量比)比例加入生理盐水，匀浆，以400×g离心10min，取上清 200μl，稀释成 5倍体积浓度，测酶活性。采用考马斯亮蓝法分别测定蛋白含量。严格按试剂盒说明操作。

1.5 膈肌超微结构观察

取膈肌组织，制成1 mm3小块，置于2.5%戊二醛溶液中固定，常规PBS漂洗，丙酮梯度脱水，E-pon812包埋。LKB超薄切片机切片，日立H600A型透射电镜下观察。

1.6 数据统计

2 结果

2.1 各组大鼠膈肌收缩能力的比较

与对照组比较，糖尿病组大鼠膈肌Pt、P0、FI水平明显降低(P ＜0.01);GbE治疗组 Pt、P0、FI水平显著高于糖尿病组(P＜0.05，表1)。

Tab.1 Comparison of contraction capacity in diaphragm among the three groups()

Tab.1 Comparison of contraction capacity in diaphragm among the three groups()

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs diabetic

Group n Pt(kg/cm2)P0(kg/cm2) FI Control 100.73±0.11 1.96±0.17 0.46±0.10Diabetic 90.37±0.12**1.09±0.33**0.29±0.04**GbE treatment 100.52±0.16**#1.56±0.50*#0.40±0.13#

2.2 各组大鼠膈肌能量代谢酶的比较

与对照组比较，糖尿病组大鼠膈肌CCO、LDH、SDH活性明显降低(P＜0.01);GbE治疗组CCO、LDH、SDH活性显著高于糖尿病组(P＜0.01，P＜0.05，表 2)。

Tab.2 Comparison of the activities of energy metabolism enzymes in diaphragm among the three groups()

Tab.2 Comparison of the activities of energy metabolism enzymes in diaphragm among the three groups()

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs diabetic

Group n CCO(U/mg pro)LDH(U/g pro)SDH(U/mg pro)Control 1032.44±5.671.62±0.27 15.57±1.16 Diabetic 921.65±7.41**1.34±0.32**10.32±1.80**GbE treatment 1028.91±6.46#1.48±0.39#13.34±2.08##

2.3 膈肌超微结构观察

正常对照组大鼠膈肌线粒体呈圆形或椭圆形，无肿胀，线粒体膜完整，线粒体嵴呈同心圆或纵行排列，嵴密集清晰、排列规则;肌原纤维密集，排列整齐，肌节各带清晰(图1A)。糖尿病组大鼠膈肌线粒体肿胀，膜模糊不清，部分膜破裂，嵴排列紊乱，数量减少甚至消失形成空泡，肌原纤维排列紊乱(图1B)。GbE治疗组大鼠膈肌线粒体超微结构明显轻于糖尿病组，多数线粒体嵴排列较规则，少数嵴肿胀模糊及断裂或空泡现象;肌原纤维排列整齐，各带清晰(图1C)。

Fig.1 Ultrastructure of diaphragm from three groups(×20k)

3 讨论

糖尿病的高血糖状态具有普遍的毒性作用，骨骼肌也是糖尿病损伤的主要部位。糖尿病对膈肌结构、功能的损害，有别于其它骨骼肌[5]。膈肌除具有骨骼肌的一般生化、生理和结构功能外，尚具有终身持续收缩特性，对于维持正常的肺功能，具有极其重要的作用。应用高糖高脂饲料加低剂量链脲佐菌素造成大鼠空腹血糖、胰岛素水平明显升高，同时伴有高血脂，出现类2型糖尿病的特征[6]。本实验结果显示的大鼠模型膈肌收缩能力(Pt、P0)和抗疲劳能力(FI)下降和以往的研究结果类似[4]。电镜检查也证实了2型糖尿病大鼠膈肌损伤的存在。

酶是机体进行代谢活动所必须的重要物质。在呼吸肌，包括CCO、SDH在内的众多酶类的正常活性，是维持呼吸运动的一个极为重要的物质基础。CCO位于线粒体内膜，可以直接将电子传递给氧，使氧被激活成氧离子，是呼吸链中的最后一个递电子体。由于CCO是呼吸链的终端，其活性强度直接影响着呼吸链传递电子的效率，对于细胞能量的产生有非常重要的意义。LDH是糖酵解代谢途径中的关键酶，反映肌肉的无氧代谢水平。SDH结合在线粒体内膜上，是三羧酸循环中唯一与内膜结合的酶，其活性标志着三羧酸循环进程的快慢，反映对有氧代谢能力的影响。本实验结果显示糖尿病组大鼠膈肌CCO、LDH、SDH活性下降，可能提示2型糖尿病大鼠8周时膈肌呼吸链电子传递障碍，糖酵解和有氧氧化代谢能力下降，说明糖尿病时膈肌组织存在能量代谢障碍。电镜下糖尿病大鼠膈肌主要表现为线粒体扩张、嵴变短、空泡化，也进一步证实了这一点。但沈兴平等[7]报道1型糖尿病大鼠4周时膈肌SDH活性增强，认为糖尿病早期膈肌为适应机体代谢变化，以有氧氧化代谢提供肌肉收缩能量。随着病程延长，线粒体损伤的加剧，最终导致SDH活性下降。

GbE是从银杏科植物银杏的叶中分离纯化的提取物，其主要有效成分为黄酮苷类和萜烯内酯类，具有抗氧化、抗炎、降糖、降脂、改善胰岛素抵抗等作用[8]。研究表明GbE能显著提高骨骼肌的收缩能力，延缓疲劳的发生[9]。我们前期的研究证实GbE不仅对糖尿病大鼠多个脏器有保护作用，并减轻膈肌线粒体和心肌组织自由基损伤和抑制NO的产生，从而对其起到保护作用[2，10]。本研究结果提示，GbE能够增强2型糖尿病大鼠膈肌有氧氧化代谢和糖酵解能力，改善线粒体呼吸链的功能，加强膈肌能量供应，从而提高膈肌的收缩能力。

[1]McGuire M，MacDermott M.The influence of streptozotocininduced diabetes and the antihyperglycaemic agent metformin on the contractile characteristics and the membrane potential of the rat diaphragm[J].Exp Physiol，1998，83(4):481-487.

[2]李旭升，陈国荣，毛孙忠，等.银杏叶提取物对糖尿病大鼠膈肌的保护作用[J].中国病理生理杂志，2004，20(7):1234-1237.

[3]Coombes J S，Powers S K，Rowell B，et al.Effects of vitamin E andα-lipoic acid on skeletal muscle contractile properties[J].J Appl Physiol，2001，90(4):1424-1430.

[4]沈兴平，舒昌达，何 军.糖尿病大鼠膈肌功能和形态学变化[J].中国病理生理杂志，2002，18(8):970-973.

[5]Merino-Ramirez M A，Juan G，Ramon M，et al.Electrophysiologic evaluation of phrenic nerve and diaphragm function after coronary bypass surgery:prospective study of diabetes and other risk factors[J].J Thorac Cardiovasc Surg，2006，132(3):530-536.

[6]周 贞，蒋天康，陈海清，等.银杏叶提取物对2型糖尿病大鼠肝功能的影响[J].中药药理与临床，2008，24(4):44-46.

[7]沈兴平，舒昌达，李琼英，等.糖尿病大鼠膈肌酶组织化学研究[J].中国病理生理杂志，2002，18(10):1276-1279.

[8]Kudolo G B，Delaney D，Blodgett J.Short-term oral ingestion of Ginkgo biloba extract(EGb 761)reducesmalondialdehyde levels inwashedplatelets of type 2 diabetic subjects[J].DiabetesResClin Pract，2005，68(1):29-38.

[9]谢 伟，杨永亮，梁 莉，等.银杏黄酮对骨骼肌抗疲劳能力的影响[J].中国临床康复，2006，10(36):98-100.

[10]李旭升，陈国荣，李剑敏，等.银杏叶提取物对糖尿病大鼠心肌损伤的防护作用[J].中国应用生理学杂志，2005，21(2):176-178.