高龄老年心衰患者外周血淋巴细胞GRK2的表达研究*

高文谦，马锦玲，韩春光，王 琼，朱 平，杨庭树

(1.解放军总医院老年心血管一科，北京 100853;2.军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)

慢性心力衰竭是各种心脏疾病的终末阶段，已严重影响人们的生活质量和寿命，其发病机制已成为当前的热点。近年来的研究推测，衰竭的心脏最重要的表现之一就是其β肾上腺素受体(β-adrenegic receptor，βAR)信号系统受损，导致其对收缩性刺激敏感性下降。G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)激酶(kinases，GRKs)是丝/苏氨酸激酶的一个家族，对βARs和GPCRs有脱敏作用[1]。研究提示心衰病人βAR信号的丢失与心肌G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinases 2，GRK2)的表达和活性增高有关，被认为是心衰病理机制最常见的一种早期表现，也是心脏功能不全的一种新的早期标志[2]。有研究显示外周血淋巴细胞能够表达GRK2，并且能反映心肌GRK2的表达状态和心肌功能损害的程度[3]，但目前国外此类文献报道数量少，缺少对高龄老年心衰患者外周血淋巴细胞GRK2表达的研究。本文旨在观察80岁以上高龄老年心衰患者外周血淋巴细胞GRK2的表达与心脏射血分数(ejection fraction，EF)的关系，为高龄心衰患者的病理生理研究及防治提供资料。

1 材料与方法

1.1 对象与分组

选取近两年我科收治16位慢性心衰的高龄男性患者，并按患者的心脏EF值将心衰组分为两个亚组:心衰A组(A):EF＜45%，共7例(年龄:85±3.2岁)。心衰B组(B):EF≥45%，共9例(年龄:84±2.8岁)。选取8位无心衰老年男性(83±2.6)作为对照组。

1.2 主要试剂

材料:人淋巴细胞分离液，天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品，Trizol试剂，博迈德生物技术有限公司;人 β-actin引物:上游 5'-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3'，下游 5'-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3';人 GRK2引物:5'-GAACACATGCACAATCG-3'，5'-CCAGGGAGAACCAGTC-3'。上述引物均由北京赛百胜公司合成。

1.3 外周血淋巴细胞分离

采集静脉血，每份2 ml，EDTA抗凝。将人抗凝静脉血以PBS稀释并混匀，再加至装有淋巴细胞分离液的离心管中，使三者体积比为1∶1∶1;混合液离心(2000r/min，30min)分层，小心吸出中间淋巴细胞层，以PBS离心洗涤2次，并计数。

1.4 RT-PCR检测目的基因

取等量的淋巴细胞离心后，沉淀细胞再以Trizol试剂按常规步骤提取总 RNA，经反转录(45℃30min，99℃5min，5℃5 min)得到cDNA 库，用于内参β-actin和目的基因GRK2的PCR扩增。二者的扩增条件:94℃30s，55℃30s，72℃45 s，共30个循环。所得产物经琼脂糖凝胶电泳分离。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 高龄老年心衰患者的情况

使用美国GE Vivid 7彩色超声诊断仪，按常规方法检测心脏EF值，并进行统计，结果归纳如表1。

Tab.1 EF of heart failure patiants(%，)

Tab.1 EF of heart failure patiants(%，)

EF:Ejection fractionA:EF＜45%;B:EF≥45%*P＜0.05 vs control

Group n EF Control 8 54±2.6 A 740±3.1*B 946±2.2*

2.2 心衰病人外周血淋巴细胞GRK2 mRNA的表达

分别从高龄心衰患者和健康老年人外周血分离的淋巴细胞提取RNA，经RT-PCR检测，显示心衰患者淋巴细胞表达GRK2 mRNA均高于对照组(P＜0.05);并且心衰A组高于心衰B组(P＜0.05)。图中显示，随着射血分数的减少，外周血淋巴细胞GRK2 mRNA表达增加(图1)。

Fig.1 GRK2 mRNA expression in lymphocytes

3 讨论

随着人们生活水平的提高，心血管疾病的发病率逐年增高，心衰的发生率也有明显增加，高龄老年心衰的死亡率居高不下。采用简便可靠的方法，能够及时了解心衰的发生、发展过程，准确给予相应的治疗措施，避免心功能进一步恶化，延长患者的生命，显得尤为重要。

大量的研究表明，心肌βAR信号系统异常是慢性心衰最重要的发病机理之一，而βAR信号系统的异常与心肌GRK2的表达和活性增高有关[4，5]。将βARKct基因转入心衰的心肌细胞，抑制心肌GRK2的表达，可使衰竭的心脏的βAR信号系统恢复正常，心肌收缩功能有明显改善，心肌的重塑出现逆转[6，7]。所以，检测心衰患者GRK2的表达和活性，可以预测心衰患者心肌功能的发展程度，也可判断心衰治疗措施的疗效。Jonathan等[8]观察了需要心脏外科手术治疗的心衰晚期患者心肌表达GRK2表达的情况，发现应用心脏辅助装置改善心脏功能后，心肌GRK2的表达、活性水平均明显减低，与其外周血淋巴细胞GRK2的表达一致。Guido等[3]在临床研究中也得出了相类似的结果。说明检测心衰患者外周血淋巴细胞GRK2的表达水平，即可了解患者心肌GRK2的表达情况，并可重复检测，克服了取心肌标本难度大、不宜检测GRK2的困难，对慢性心衰的研究和防治显得尤为重要。由于心脏结构的特殊性，很难取得足够的标本，以及患者条件的限制，至今此类临床研究较少，目前尚未见高龄老年心衰患者的相关研究。

本文用RT-PCR检测了高龄老年心衰患者外周血淋巴细胞GRK2的表达，发现随着心脏射血分数的减低，淋巴细胞GRK2mRNA的表达增加。上文述及，GRK2目前认为是反映慢性心衰的重要标志之一，但在老年患者，特别是高龄老年患者中的变化规律报道并不多见。我们的结果表明，在高龄老年慢性心衰患者中，越是EF值低的患者，其外周血淋巴细胞GRK2的表达水平越高，呈现明显的负相关性。故实验结果提示，检测淋巴细胞GRK2的表达可了解高龄老年心衰患者心肌功能病理状态，进而判断治疗措施对心衰的疗效，为高龄老年心衰的防治研究积累资料。

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