滋水清肝饮对围绝经期抑郁症模型大鼠海马神经元细胞凋亡相关因子的影响

赵珂 金季玲

围绝经期抑郁症是指初次发病于围绝经期，以情绪低落、焦虑不安、失眠为主要症状的疾病[1]。对围绝经期抑郁症的流行病学调查显示：我国围绝经期抑郁症患者占围绝经期人群的5.8%[2]，占围绝经期综合征患者的78%[3]。近年来因中医药治疗本病疗效肯定且毒副作用少而日益引起关注。本课题采用动物实验研究的方法，应用具有补肾疏肝、宁心安神作用的滋水清肝饮为治疗药物，应用免疫组化法，从海马神经元细胞凋亡及其相关基因蛋白表达的角度探讨了围绝经期抑郁症中药治疗的干预环节。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性SD清洁级大鼠45只，体重200～230 g，由北京中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，使用许可证编号：SCXK-(军)2002-001。

1.2 实验药品

中药：根据滋水清肝饮方制备。方药组成：熟地12 g，山茱萸12 g，山药12 g，丹皮10 g，泽泻10 g，茯苓10 g，白芍12 g，当归12 g，柴胡10 g，酸枣仁15 g，栀子10 g。

西药：盐酸氟西汀胶囊，每粒20 mg。生产厂：Eli Lilly and Company Limited Kingsclere Road，Basingstoke，分装厂：礼来苏州制药有限公司。

雌二醇注射液：每支1 mg。生产厂：天津金耀氨基酸生产有限公司。

1.3 主要仪器及试剂

全自动切片机、全自动多功能显微镜、数码采集及分析系统、染色缸、湿盒、孵育箱、盖玻片、光镜、微量移液器等。原位细胞凋亡检测试剂盒TUNEL(天津灏阳生物公司批号：TBD2020POD)；Bax免疫组化成套染色系统(天津灏阳生物公司批号：RSC526K)；Bcl-2免疫组化成套染色系统(天津灏阳生物公司批号：RSC492K)。

1.4 模型建立与实验分组

将实验大鼠按照体重分层随机分组(随机数字表法)。每组9只。假手术组；围绝经期抑郁症模型组(简称模型组)；围绝经期抑郁症滋水清肝饮治疗组(简称中药组)；围绝经期抑郁症雌二醇+盐酸氟西汀治疗组(简称雌二醇+盐酸氟西汀组)；围绝经期抑郁症雌二醇治疗组(简称雌二醇组)。假手术组行假手术。其余各组大鼠分别行卵巢摘除术及慢性不可预见应激，造成围绝经期抑郁症动物模型。实验过程中6只大鼠死亡，其中模型组、雌二醇+盐酸氟西汀组灌胃时各死亡1只，中药组冰水游泳淹死2只，雌二醇组禁食时死亡1只，热水游泳淹死1只。

1.5 给药

第一轮刺激结束后开始给药，连续给药21天。所给药物按照临床人用剂量，根据每公斤体重用药量的人鼠比例换算[4]，由本院制剂室加工成水煎剂，使每毫升含生药1.0 g，置冰箱保存备用。

中药组、雌二醇+盐酸氟西汀组、雌二醇组在第一轮刺激结束后开始给药。中药组给予滋水清肝饮(11.25 g生药/kg)灌胃，每日1次；雌二醇+盐酸氟西汀组给予盐酸氟西汀混悬液(1.8 mg/kg)灌胃每日1次加雌二醇(0.18 mg/kg)隔日1次肌内注射；雌二醇组给予雌二醇肌内注射隔日1次。3组均连续给药21天。假手术组、模型组分别给予生理盐水2 ml/d灌胃。

1.6 动物处死及取材

末次治疗24小时后，颈椎脱臼法处死大鼠，迅速断头，于冰盘上迅速分离全脑，右侧半脑称量湿重后，置于中性福尔马林液固定，用于免疫组化切片。采用石蜡包埋切片法。

1.7 免疫组化的实验步骤

参照原位细胞凋亡检测试剂盒TUNEL、Bax免疫组化成套染色系统、Bcl-2免疫组化成套染色系统、说明书提供的实验步骤，由天津灏洋生物公司协助完成。

1.8 观察方法

每只大鼠取2张相应部位切片，每张切片随机取海马CA3区的5个高倍视野(40×10)进行分析。Tunel法检测细胞凋亡其阳性染色者为细胞核着色，呈棕黄色者为阳性细胞，着色越重，凋亡程度越高。Bcl-2、Bax的阳性染色者为细胞胞浆着色呈棕黄色，着色越重，蛋白表达越高。对图像采用HPIAS-2000图像分析系统进行平均灰度值的分析，进行统计学比较。凋亡神经细胞记数方法：记数凋亡细胞和阴性神经细胞的平均数，计算凋亡细胞所占的百分率。以之为凋亡指数进行统计学比较。

2 实验结果

2.1 各组细胞凋亡结果比较

模型组与假手术组比较，凋亡指数升高，有显著性差异(P<0.01),经过治疗后，中药组和雌二醇+盐酸氟西汀组可以降低升高的凋亡指数，与模型组比较有显著性差异(P<0.01，P<0.05)，其中中药治疗后与假手术组比较无差异。两组西药疗效与中药组比较有显著性差异(P<0.01)，中药疗效明显优于西药组。见表1。

表1 细胞凋亡指数比较

注：与假手术组比较aP<0.01；与模型组比较bP<0.05，cP<0.01；与中药组比较dP<0.01。

2.2 Bax和Bcl-2免疫组化结果平均灰度值比较

模型组和假手术组比较，Bax的蛋白表达量升高，有显著性差异(P<0.01),Bcl-2的蛋白表达量降低，亦有显著性差异(P<0.01)。经过治疗后，Bax的表达量降低，其中以雌二醇+盐酸氟西汀组及中药组疗效最好，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，与假手术组比较差异无统计学意义。Bcl-2的表达三组治疗后呈升高趋势，以中药组及雌二醇+盐酸氟西汀组疗效最好，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，与假手术组比较差异无统计学意义。

表2 Bax和Bcl-2免疫组化结果平均灰度值比较

注： 与模型组比较aP<0.05；与假手术组比较bP<0.05，cP<0.01

3 讨论

本课题组在金季玲教授的带领下通过多年的临床及实验研究最终确立了围绝经期抑郁症的主要病机是肾精不足、肝气郁结、心神失守最终导致脑府失养发为本病。基于此确立了补肾疏肝、宁心安神的治疗原则，选取滋水清肝饮治疗该病，并且在以往的临床观察中显示了一定的优势。抑郁症的发生与脑府失养的密切关系，历代医家皆有论述。《灵枢·海论篇》说：“脑为髓之海，其输上在于其盖，下在风府，……，髓海有余，则轻劲多力，自过其度；髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”《素问·脉要精微论》云：“头者，精明之府。”明确提出了脑的解剖位置及与神明相关的功能。可见，中医早在内经时代己经明确认识到脑在精神意识思维活动中的重要性。明代医家李时珍在《本草纲目·辛夷条》提出了“脑为元神之府”，清代医家王清任在《医林改错》中指出：“灵机记性在脑不在心……所以小儿无记性者，脑髓未满，高年无记性者，脑髓渐空。”《普济方》载有：“头者，诸阳之会，……百神所聚”，喻昌《医门法律》言：“脑之为上天门，身中万神集会之所。”强调了脑总统众神，脑是精神及思维活动的发源地，一切精神及思维活动的障碍均源于脑。

本实验结果显示：模型组细胞核着色程度最强，阳性细胞数最多，说明模型组细胞凋亡程度最高。经过治疗后，中药组和雌二醇+盐酸氟西汀组的凋亡细胞指数显著降低，且中药组疗效明显优于雌二醇+盐酸氟西汀组，中药组阳性细胞数明显减少，着色程度轻，接近于假手术组。说明中药可以有效抑制海马神经元细胞凋亡的过程。通过对凋亡相关基因Bax，Bcl-2的研究表明：在模型组中促进细胞凋亡的Bax表达量较假手术组显著增强，抑制细胞凋亡的Bcl-2的表达量显著降低。中药治疗可以调节Bax，Bcl-2的表达量，增进抑凋亡基因Bcl-2的表达，降低促凋亡基因Bax的表达。这可能是中药抑制细胞凋亡，延缓神经元退行性变的作用机制之一。海马神经元细胞凋亡是海马功能发生改变的基础，可能是围绝经期抑郁症发生的病理机制之一。中药滋水清肝饮及雌激素加抗抑郁药物的治疗都能改善这一病理状态，但是从疗效看，中药组显著优于西药组，其疗效接近于假手术水平。滋水清肝饮对细胞凋亡的调节是通过作用于细胞凋亡相关基因Bcl-2家族的促进及抑制细胞凋亡的一对相关基因而起效的。

[1]林守清，徐苓.女性生殖内分泌性激素补充疗法[M].北京：中国协和医科大学出版社，1999:36-37.

[2]何敏慧，冯永林，王政科．城市社区更年期居民抑郁、焦虑状况及影响因素[J]．中华精神科杂志，1999，4(32)：22-23.

[3]卫生部继续医学教育委员会．女性生殖内分泌性激素补充疗法[M]．北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1999:36.

[4]陈奇.中药药理研究方法学.北京：人民卫生出版社，1994.