HPLC法同时测定黄芪中4种黄酮类成分的含量Δ

梁丽娟，赵奎君，屠鹏飞，姜勇

（1.首都医科大学附属北京友谊医院，北京市 100050；2.北京大学医学部药学院，北京市 100083）

2005年版《中国药典》收载的黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge或蒙古黄芪A.membranaceus var.mongholicus（Bunge）Hsiao的干燥根。黄芪是传统补益药，在《神农本草经》中列为上品，有补气升阳、益胃固表、利水消肿、脱毒生肌等功效。黄芪的主要化学成分为黄酮类和三萜皂苷[1]，其中黄酮类是黄芪的有效成分之一。为探讨黄芪道地性与其活性成分的内在联系，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法对黄芪中含量较大的4种黄酮类成分进行测定，以为黄芪多指标质量控制方法的建立提供科学、可靠的依据。

1 仪器与试药

1100型HPLC系统（美国Agilent公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D型十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）。

乙腈（色谱纯，天津市彪仕奇科技发展有限公司）；甲醇（分析纯，北京化工厂）；无水甲酸（分析纯，北京益利精细化学品有限公司）；水为重蒸水；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素标准品均由北京大学中药现代化研究中心自制，经HPLC检测纯度均＞98%；所用药材采集于相应的产地，经笔者鉴定为蒙古黄芪A.membranaceus（Fisch.）Bunge var.mongholicus（Bunge）Hsi-ao的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），KJO-4282 Phenomenex预柱；流动相：乙腈-水（含0.2%甲酸），梯度洗脱（梯度见表1）；流速：1 mL·min-1；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃，进样量：20 μL。色谱见图1。

2.2 混标溶液的制备

分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素标准品适量，加50%甲醇-水制成质量浓度约为0.5 mg·mL-1的溶液，摇匀，即得4种黄酮类成分的混标贮备液A；取贮备液A 0.5 mL，定容至5 mL，制成贮备液B；取贮备液B 0.5 mL，定容至5 mL，制成混标溶液C。

表1 流动相的梯度Tab 1 Gradient of mobile phase

2.3 供试品溶液的制备

取黄芪药材粉末（过60目筛，50℃低温烘干12 h）1.0 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加40 mL甲醇回流提取3.5 h，提取液减压浓缩至干，残渣用50%甲醇溶解并定容至5 mL，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取上述贮备液A10 μL，贮备液B10、20、30、40、50 μL，混标溶液C10、50 μL，注入液相色谱仪，测定。以进样量（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程及其线性范围，结果见表2。

表2 4种黄酮类成分的线性回归结果Tab 2 Results of linear regression of 4 kinds of flavonoids

2.5 精密度试验

精密吸取同一混标溶液连续进样5次，按4种黄酮类成分的峰面积积分值分别计算其RSD值。结果，毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的RSD分别为0.32%、0.31%、0.33%、0.29%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、10、12 h进样检测，按4种黄酮类成分的峰面积积分值分别计算其RSD值。结果，毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的RSD分别为1.2%、0.79%、0.49%、0.21%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一产地药材，精密称取样品6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述方法测定。结果，毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的平均含量（mg·g-1）和RSD分别为0.312、3.9%，0.143、3.7%，0.160、2.8%，0.095、4.2%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称定已知含量的同一批样品6份，每份约1.0 g，精密加入混标贮备液A 0.5 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述方法测定。结果，毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的平均回收率和RSD分别为99.6%、2.80%，99.8%、1.41%，100.3%、2.51%，101.4%、1.67%（n＝6）。

2.9 不同产地样品中4种黄酮类成分的含量测定

精密称取每个产地5批样品，每份约1.0 g，照“2.3”项下方法制备供试品溶液，经0.22 μm滤膜过滤后取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算含量，结果见表3。

表3 不同产地药材中4种黄酮类成分的含量测定结果（mg·g-1，n＝5）Tab 3 Contents of 4 flavonoids in different cultivated regions（mg·g-1，n＝5）

3 讨论

本试验前期工作曾对提取溶剂（甲醇、70%甲醇-水、乙醇和水）、提取方式（超声提取、回流提取和索氏提取）以及提取时间（1、2、2.5、3、3.5、4 h）进行过考察。结果表明，采用纯甲醇回流提取3.5 h时4种黄酮类成分的峰面积均达到最大值。

在色谱柱选择方面，试验分别比较了Kromasil 100 Å C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Zobax Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。结果表明，Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分离度最好。

由含量测定结果可以看出，内蒙古、山西4个产地的黄芪中毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷的含量较高；河北安国、赤城和甘肃定西产黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量较高；四川产黄芪中4种黄酮类成分含量均很低。

南北朝《名医别录》记载黄芪的最早产地为四川、甘肃和陕西省毗邻地区；唐《新修本草》中黄芪的产地向东北移至陕西中部和宁夏南部地区；元《汤液本草》中黄芪产地又从陕西逐渐移至山西，最终稳定在山西。清《植物名实图考》载：“黄芪有数种，山西、蒙古者最佳。”民国初陈仁山著的《药物出产辨》载：“正芪产区有三处：一关东，二宁古塔，三卜奎，产东三省，现时山西大同、忻州地区，内蒙古及东北产者为优。”可见，黄芪道地产品从最初的甘肃、四川北部、陕西南部，逐渐过渡至以山西、内蒙古地区的蒙古黄芪为主的趋向。本试验结果与黄芪的本草考证、道地沿革的文献基本相符。

有关黄芪中4种异黄酮含量的HPLC法同时测定曾有报道[2]，但主要是方法学的研究，所测定的药材主要为商品药材，没有涉及黄芪的道地性。本试验主要是从有效成分含量探讨药材道地性的内在因素，所测定的11批药材均由产地采集，这些产地很好地反应了黄芪道地性的历史沿革。另外，本试验对色谱条件进行了优化，选用0.2%的甲酸水为流动相，改善了拖尾现象，使分离度更好；选用280 nm为检测波长，减少了杂质峰的干扰且灵敏度高。由于4种黄酮类成分极性差别较大，故溶解样品时选用50%的甲醇使极性较大的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和极性较小的毛蕊异黄酮、芒柄花素都能很好的溶解。

对于黄芪的质量控制，以往文献也曾报道过毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素和黄芪甲苷的含量测定[3]，但均是分开测定，操作烦琐，而且仅以某一种成分的含量为指标进行质量控制，并不能反映药材的全貌。本试验建立了同时测定4种黄酮类成分含量的方法，简便、快速、准确，可用于综合评价药材的质量。

[1]肖培根.新编中药志（第1卷）[M].北京：化学工业出版社，2002：876.

[2]李小兵，谢晓梅，周铜水.高效液相色谱法同时测定黄芪中4种异黄酮的含量[J].安徽医药，2008，12（5）：413.

[3]宋永熙，曲 婷，胡宝荣，等.复方黄芪胶囊的制备及质量控制[J].中国药房，2005，16（19）：1469.