精制益母草生物碱提取纯化工艺研究Δ

郑师明，严鹏科，李世煌，段才闻，吴仲洪，肖国宏#

（1.广州医学院第三附属医院，广州市 510150；2.湖南郴州市第四人民医院心内科，郴州市 423000；3.南华大学药物药理研究所，衡阳市 421001）

益母草，《神农本草经》原名茺蔚，为唇形科益母草属植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的全草，我国大部分地区都有分布，具有来源广、易得到、常规剂量无毒副作用的特点。现代药理研究发现，益母草具有扩张冠脉、增加冠脉血流、溶栓、抗凝、降脂、降血黏度、降低红细胞聚集、抑制血小板聚集、改善微循环、抗氧自由基、减少细胞内钙超载、兴奋子宫、利尿等诸多作用，从而为其用于临床提供了广泛的药理学基础[1]。

市售益母草注射液，由于提取工艺和纯度等不足，目前国家只批准用于肌肉注射并用于产后出血。近年有初步研究报道，其可用于心肌缺血的防治，且疗效确切[1]。由于心肌缺血引起的心血管疾病具有发病快、病情急、危害严重等特点，静脉注射能较快控制病情，患者易于接受。因此，对可用于静脉注射的精制益母草生物碱的生产工艺有必要作进一步研究。

1 材料

1.1 仪器

石英回流装置（上海精密科学仪器有限公司）；超声提取器（深圳市科工达超声设备有限公司）；SHB2B95型循环真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；旋转蒸发仪（上海博通化学科技有限公司）。

1.2 试药

益母草粗粉（产地安徽）经湖南九芝堂药店鉴定并加工为饮片；水苏碱标准品（陕西森弗生物技术有限公司，批号：20080307，含量：＞99%）；水苏碱标准品ADS-A、ADS-B、ADS-C、ADS-D型制药用级特制品大孔树脂（南开合成科技有限公司）；雷氏盐、无水乙醇、盐酸、丙酮、盐酸乙醇等试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 超声提取法

2.1.1 70%乙醇结合超声提取：称取100 g益母草粗粉，置于3000 mL圆底烧瓶中，加入8倍量体积的70%乙醇，振摇使充分混匀，先浸泡30 min，再超声40 min，过滤，滤液置旋转蒸发仪减压蒸馏（温度为75℃）至体积为100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，备用。

2.1.2 95%乙醇结合超声提取：称取100 g益母草粗粉，置于4000 mL圆底烧瓶中，加入8倍量体积的95%乙醇，振摇使充分混匀，先浸泡30 min，再超声40 min，过滤，滤液置旋转蒸发仪减压蒸馏（温度为75℃）至体积为100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，备用。

2.1.3 0.05%盐酸乙醇超声提取：加入0.05%盐酸乙醇，提取方法同“2.1.2”项。

2.2 回流提取法

2.2.1 70%乙醇结合回流提取：称取100 g益母草粗粉，置于4000 mL圆底烧瓶中，加入8倍量体积的70%乙醇，振摇使充分混匀，先浸泡10 min，再加热至70～80℃回流2 h，过滤，滤液置旋转蒸发仪减压蒸馏（温度为75℃）至体积为100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，备用。

2.2.2 95%乙醇结合回流提取：称取100 g益母草粗粉，置于4000 mL圆底烧瓶中，加入8倍量体积的95%乙醇，振摇使充分混匀，先浸泡10 min，再加热至70～80℃回流2 h，过滤，滤液置旋转蒸发仪减压蒸馏（温度为75℃）至体积为100 mL左右，放入烘箱中烘干至恒重，备用。

2.2.3 0.05%盐酸乙醇回流提取：加入0.05%盐酸乙酸，提取方法同“2.2.2”项。

2.3 浸渍提取法

2.3.1 1%盐酸浸渍法：取100 g益母草粗粉，用8倍体积的1%盐酸（约3000 mL）在室温（20℃）浸泡24 h，过滤后将滤液置于旋转蒸发仪中减压蒸馏（80℃），浓缩至1 mL相当于原药1 g即可（约100 mL），备用。

2.3.2 1%磷酸浸渍法：取100 g益母草粗粉，用8倍体积的1%磷酸（约3000 mL）在室温（20℃）浸泡24 h，过滤后将滤液置于旋转蒸发仪中减压蒸馏（80℃），浓缩至1 mL相当于原药1 g即可（约100 mL），备用。

2.4 生物碱的离子交换法纯化

2.4.1 树脂最大吸附量的确定：分别取1 g树脂加入25 mL 1.72 mg·mL-1的提取液中，调pH值分别至6、7、8，25 ℃恒温振荡，2 h后定量吸取溶液，过滤沉淀，计算各种上清液中生物碱含量，上样量与此值的差为理论吸附量或树脂的静态吸附容量。

2.4.2 样品纯化：取最佳优化工艺的提取液，调定pH值，过柱并吸附饱和的大孔树脂，去离子水洗至中性，10%、30%、50%、70%、90%乙醇依次洗脱，收集每一洗脱液，生物碱沉淀，薄层层析判断有效成分。有效洗脱成分减压浓缩，浓缩液以NaOH调pH至不产生沉淀为止。静置过夜，离心沉淀物，去离子水洗至中性，干燥，无水乙醇溶解，过滤，减压滤液浓缩，真空干燥。

2.4.3 检测：以丙酮为空白，在最大波长510 nm处测各样本的吸光度（A），再代入公式中计算生物碱的含量（W＝179.63×10×A/106.5）。水苏碱标准品用于检测该方法的准确度。此试验制备了3个不同浓度的样品分别测定3次，结果回收率为100.6%，表明该方法的准确度达到要求。

2.4.4 干膏质量的测定：将样品液过滤，精确定容至100 mL，置烘箱中干燥为粉末，称重。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 精制益母草生物碱提取工艺的筛选

3.1.1 不同溶剂超声提取对精制益母草生物碱提取率的影响：通过3次对不同批号（20080403、20060504、20060507）药物原料的提取研究发现，超声结合不同溶剂提取对精制益母草生物碱提取率的影响不同，其中70%乙醇的平均生物碱提取率为0.22%，95%乙醇的提取率为0.29%，0.05%盐酸乙醇的提取率为0.373%。结果表明，在超声法中以0.05%盐酸乙醇提取的干膏生物碱含量和提取率最高。

3.1.2 不同溶剂回流提取对精制益母草生物碱提取率的影响：通过3次对不同批号药物原料的提取研究发现，回流法结合不同溶剂提取对精制益母草生物碱提取率的影响不同，其中70%乙醇的平均生物碱提取率为0.217%，95%乙醇的提取率为0.303%，0.05%盐酸乙醇的提取率为0.317%。结果表明，在回流法中以0.05%盐酸乙醇提取的干膏生物碱含量和提取率最高。

3.1.3 不同溶剂冷浸提取对精制益母草生物碱提取率的影响：通过3次对不同批号药物原料的提取研究发现，冷浸法结合不同溶剂提取对精制益母草生物碱提取率的影响不同，其中1%盐酸的平均生物碱提取率为0.410%，1%磷酸的提取率为0.340%。结果表明，在浸渍法中以1%盐酸提取的干膏生物碱含量和提取率最高。

3.2 正交设计优化精制益母草生物碱提取工艺

3.2.1 超声提取法正交设计优化：结合实际情况，做L9（34）正交试验，考虑溶剂浓度、溶剂用量、处理时间、处理次数4个因素，每个因素取3个水平，设计正交表，用雷氏盐沉淀溶解比色法测定总生物碱含量。结果表明，超声提取法最佳提取工艺为溶剂浓度1%，溶剂量8倍，处理60 min，处理1次（具体试验另文发表）。

3.2.2 回流提取法正交设计优化：考虑溶剂浓度、溶剂用量、处理时间、处理次数4个因素，每个因素取3个水平，设计正交表，用雷氏盐沉淀溶解比色法测定总生物碱含量。结果表明，回流提取法最佳提取工艺为溶剂浓度1.5%，溶剂量4倍，处理60 min，处理3次（具体试验另文发表）。

3.2.3 浸渍提取法正交设计优化：考虑溶剂浓度、溶剂用量、处理时间、处理次数4个因素，每个因素取3个水平，设计正交表，用雷氏盐沉淀溶解比色法测定总生物碱含量。结果表明，浸渍提取法最佳提取工艺为溶剂浓度1%，溶剂量8倍，处理24 h，处理3次（具体试验另文发表）。

3.3 精制益母草生物碱纯化工艺及其优化

3.3.1 不同ADS大孔树脂对精制益母草生物碱的静态吸附作用：在提取液的pH为6～8之间时，4种ADS大孔树脂对生物碱均有吸附作用。其中，pH值为8时ADS-B的静态吸附最强。研究过程中观察到，当提取液的pH值为4、5时，各种树脂的静态吸附很少；pH值为9、10、11时，提取液出现沉淀反应，影响过柱效果。不同ADS型号树脂、pH值对精制益母草生物碱静态吸附作用的影响见表1。

表1 不同ADS型号树脂、pH值对精制益母草生物碱静态吸附作用的影响Tab 1 Effect of different ADS macroporous resin and pH on static absorbability of alkaloid of L.japonicus

3.3.2 不同ADS大孔树脂对精制益母草生物碱的纯化作用：不同ADS柱纯化精制益母草生物碱的回收效率不同，ADS-C回收生物碱的量最高（以水苏碱含量为判断指标），但回收物干膏的生物碱含量仅为2.8%；ADS-B回收生物碱的量略低于ADS-C，但回收物干膏的生物碱（以水苏碱含量为判断指标）含量已达38.6%，符合国家中药新药技术要求：所测定成分的总含量应不低于总固体量的20%（静脉用不少于25%）。不同ADS型号树脂对精制益母草生物碱纯化作用的影响见表2。

4 讨论

益母草的主要化学成分有生物碱类、二萜类、黄酮类、挥发油类、微量元素等[1]，其中生物碱类一直被认为是益母草的有效成分，用作质量控制的指标。生物碱类主要包括益母草碱、水苏碱、益母草啶等。本研究中笔者提取出的精制益母草生物碱，与常规提取的益母草生物碱比较有更强的抗心肌缺血作用，且无明显毒副作用（结果另文发表）。

表2 不同ADS型号树脂对精制益母草生物碱纯化作用的影响Tab 2 Effect of different ADS macroporous resin on purification of alkaloid of L.japonicus

目前临床应用的益母草制剂的提取工艺一直都采用水提醇沉、浓缩干燥的方法，有效成分得率低，含杂质较多，制约了将其进一步制成现代化的剂型。因此，研制新型益母草制剂首先需加强益母草提取精制工艺研究。

超声提取法是一种简便、不需加热、提取时间短的现代中药提取方法[2]，适用于固体制剂中测定组分的提取，应用日益广泛。研究发现，超声结合不同溶剂提取对精制益母草生物碱提取率的影响不同，其中溶剂A的平均生物碱提取率为0.220%，溶剂B的提取率为0.290%，溶剂C的提取率为0.373%。在超声法中，以溶剂C的提取干膏生物碱含量和提取率最高。

回流提取法克服了一般的冷浸、煎煮等法因提取时间长影响提取率的缺点，利用有机溶剂的相似相溶原理，用不同浓度的溶剂进行回流提取，再用雷氏盐比色法进行测定，用光谱法测量益母草提取液中的总碱量，从而探讨不同溶剂、不同浓度和不同提取时间对益母草总碱提取率的影响。研究发现，回流法结合不同溶剂提取对精制益母草生物碱提取率的影响不同，其中溶剂A的平均生物碱提取率为0.217%，溶剂B的提取率为0.303%，溶剂C的提取率为0.317%。

浸渍提取法一般是在常温下进行，对热敏性的物质的提取很有利，但所需时间长，尤其是水作溶剂时易发霉变质。在传统的酸提法中加入95%的乙醇可增加其提取效率，缩短时间。本研究即对以酸及醇为溶剂的方法进行了初步的探索。研究发现，浸渍法结合不同溶剂提取对精制益母草生物碱提取率的影响不同，其中溶剂A的平均生物碱提取率为0.410%，溶剂B的提取率为0.340%。

大孔树脂吸附技术是20世纪70年代发展起来的一种新工艺，是将中草药提取液通过大孔树脂，吸附其中的有效成分，再经洗脱回收，除掉杂质的一种纯化精制方法[3～5]。该技术目前已较广泛应用于中药新药的开发和中成药的生产中，主要用于分离和提纯过程。笔者选用了南开大学的药用级ADS-A、ADS-B、ADS-C、ADS-D 4种树脂进行比较研究，发现在提取液的pH值为6～8之间时，4种ADS大孔树脂对生物碱均有吸附作用，其中pH值为8时ADS-B的静态吸附最强。

[1]阮金兰，杜俊蓉，曾庆忠，等.益母草的化学、药理和临床研究进展[J].中草药（增刊），2003，34（11）：15.

[2]张 颖，巩学勇，冀海伟，等.翻白草中槲皮素的提取工艺优化及含量测定[J].中国药房，2008，19（30）：2345.

[3]史作清，施荣富，王春红，等.树脂吸附法在中草药有效成分提取中的应用[J].中草药，2001，32（7）：660.

[4]何 琦，丁立生.大孔吸附树脂银杏黄酮提取纯化性能研究[J].天然药物研究与开发，2000，13（1）：56.

[5]马振山.大孔树脂吸附在药学领域中的研究应用[J].中成药，1997，19（12）：40.