大黄藿苓汤对慢性肾衰大鼠成纤维细胞生长因子表达的影响*

韩顺平，杨幼新，苑朝升，杨 曼，马 艳

（1.天津中医药大学国际教育学院，天津 300193；2.解放军272医院，天津 300020）

大黄藿苓汤对慢性肾衰大鼠成纤维细胞生长因子表达的影响*

韩顺平1，杨幼新1，苑朝升2，杨 曼2，马 艳1

（1.天津中医药大学国际教育学院，天津 300193；2.解放军272医院，天津 300020）

[目的]探讨大黄藿苓汤对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏的保护作用及机制。 [方法]采用腺嘌呤造模，设空白组、模型组、治疗1、2组。[结果]治疗1、2组肾脏病理改变较模型组轻，尿素氮、肌酐、尿酸、成纤维细胞生长因子（bFGF）表达治疗1组较模型组减少（P<0.05），治疗2组与模型组相比bFGF表达无明显差异。[结论]大黄藿苓汤对腺嘌呤致慢性肾衰大鼠肾脏有保护作用，且早期用药优于晚期用药，其机制可能是抑制bFGF表达。

大黄藿苓汤；腺嘌呤；慢性肾衰；bFGF

慢性肾功能衰竭（CRF）是由多种慢性肾脏疾病发展到晚期，肾实质损害引起临床综合征。其临床症状复杂，死亡率较高，透析和肾脏移植是治疗该病的重要手段，但治疗费用较高，尚未普及。因此，CRF的非透析疗法为国内外医家所重视。大黄藿苓汤是临床治疗CRF的有效方药。为探讨其作用机制，本实验观察了大黄藿苓汤对腺嘌呤所致大鼠慢性肾功能衰竭成纤维细胞生长因子的影响，现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠40只，体质量150～180 g，由中国医学科学实验动物研究所繁育场提供。

1.2 实验药品 腺嘌呤（Adenine，C5H5N5，FW：135.13）购于上海伯奥生物科技有限公司，进口分装，批号：020508。用时加蒸馏水配成2%混悬液，置4℃冰箱备用，混匀后使用。大黄藿苓汤：由大黄、淫羊藿、猪苓、茯苓、雷公藤、莪术、丹参、红花、当归等药物组成，药材由解放军第272医院中药房提供，煎成生药浓度为7.04kg/L的煎剂装瓶，置4℃冰箱备用。

1.3 主要试剂 成纤维细胞生长因子（bFGF）试剂盒，采用武汉博士德生物工程公司进口分装试剂盒。使用日立7020全自动生化仪、光学显微镜、美国600CL PISERA彩色图像分析仪等仪器进行检测分析。

2 实验方法

2.1 分组及造模方法 40只大鼠购入后，适应性喂养1周，随机分为4组，即空白组、模型组、治疗1组、治疗2组，每组各10只。除空白组外，各组按250mg/（kg·d）给大鼠腺嘌呤灌胃[1-2]空白组用等量生理盐水灌胃，造模用药21 d，并于第21天经眼眶取血做肾功能检查。

2.2 给药方法 空白组、模型组：实验开始至51 d实验结束，1次/d，2mL/只生理盐水灌胃；治疗1组：实验开始至51 d实验结束，1次/d，大黄藿苓汤2mL/只灌胃；治疗2组：实验开始至21 d，1次/d，2mL/只生理盐水灌胃，实验22～51 d实验结束，大黄藿苓汤2mL/只灌胃。治疗过程中大鼠自由进食、饮水。

2.3 观察指标

2.3.1 尿素氮、肌酐、尿酸、血钙、血磷 血标本离心，取血清，日立7020型全自动生化仪测定。

2.3.2 肾组织形态学 肾脏标本10%甲醛固定，石蜡包埋，常规苏木-伊红（HE）染色，光镜观察。

2.3.3 免疫组化染色 石蜡切片脱蜡，3%过氧化氢灭火内源性酶，电炉煮沸抗原修复，5%～10%正常山羊血清封闭，滴加适当比例稀释的一抗、二抗及适当比例的辣根酶标记链霉卵白素，二氨基联苯胺（DAB）显色。

2.4 统计学处理方法 计量资料用单因素方差分析，等级资料使用秩和检验。

3 结果

3.1 第21天时各组生化指标测定结果 见表1。

通过表1可以看到，在第21天时，模型组尿素氮、肌酐、尿酸均明显高于空白组（P<0.01），说明造模成功。在造模同时预防性治疗1组在第21天时，尿素氮、血肌酐、尿酸的上升水平明显低于模型组，即肾功能损害明显轻于模型组，但血钙、血磷的变化不明显。

表1 第21天时各组生化指标测定结果(±s)Tab.1 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 21stday(±s)

表1 第21天时各组生化指标测定结果(±s)Tab.1 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 21stday(±s)

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较△P<0.05。

组别空白组模型组治疗1组血磷(mmol/L)2.18±0.41 4.64±1.09**4.40±0.53**尿素氮(mmol/L)8.94±0.397 26.48±6.42**23.33±6.06**△肌酐(μmol/L)33.2±3.82 92.3±25.79**76.9±16.18**△尿酸(mmol/L)194.57±44.76 337.67±133.25**309.6±115.99**△血钙(mmol/L)2.21±0.08 2.10±0.17 2.29±0.14

3.2 第51天时各组生化指标测定结果 见表2。

表2 第51天时各组生化指标测定结果(±s)Tab.2 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 51stday(±s)

表2 第51天时各组生化指标测定结果(±s)Tab.2 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 51stday(±s)

注：与空白组比较，**P<0.01；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△△P<0.01；与模型组比较，△P<0.05。

组别空白组模型组治疗1组治疗2组尿素氮(mmol/L)7.42±0.96 15.27±3.62*10.89±1.42△10.79±1.98△肌酐(μmol/L)31.2±6.56 60.6±7.60**34.3±4.69△35.7±6.77△尿酸(mmol/L)111.04±21.12 199.56±24.56**92.73±15.34△△121.29±45.19△血钙(mmol/L)2.17±0.37 2.22±0.35 2.30±0.27 2.32±0.48血磷(mmol/L)1.92±0.29 4.47±0.30**2.01±0.28△2.07±0.49△

通过表2可以看出，治疗1、2组肾功能、血磷指标均明显好于模型组，表明大黄藿苓汤可以明显抑制肾衰的进展，治疗1、2组之间无明显差别，治疗1组较治疗2组肾功能进展有减慢的趋势。

3.3 病理学观察 空白组：肾组织如常，组织学均未见著变。模型组：肾体积均明显增大。个别动物肾体积较正常对照组可增大1倍以上。各肾均存在区域性肾单位萎缩、消失，纤维组织增生明显及炎细胞浸润。部分肾小管上皮细胞坏死、消失或扩张，甚者呈囊性。肾实质内肾小球数目明显减少并可见大小不一、数量不等的棕褐色结晶或异物肉芽肿形成及粉染匀质的管型。治疗1组：肾病变较模型对照组明显减轻，肾体积除个别动物外，均略增大或接近正常对照组，肾单位萎缩、消失，纤维组织增生面积较小且局限在近被膜的皮质部分。除个别动物外，扩大的肾小管及结晶体形成均减轻，部分肾组织学与正常对照组比较大致相似。治疗2组：肾病变较模型对照组减轻，区域性肾单位萎缩消失。纤维组织增生面积较模型组小；扩大的肾小管及肾实质内的结晶体亦少些。

3.4 免疫组化结果 测量方法采用半定量方法进行判定，每张切片观察10个视野，细胞核被染成棕褐色定为阳性结果。半定量方法是根据每张切片阳性反应颗粒的颜色深浅和占细胞总数的比例来测量：阴性（－）：未见或偶见阳性颗粒，颜色成浅黄色：阳性（＋）：阳性颗粒少于1/3，颜色呈浅棕黄色；中等阳性（＋＋）：阳性颗粒介于 1/3～2/3，颜色介于+ ～+++ 间；强阳性（＋＋＋）：阳性颗粒大于 2/3，颜色呈棕褐色。成纤维细胞生长因子免疫组化结果为：近曲、远曲间质、血管内细胞及血管内皮都有阳性表达，正常对照组肾小管及间质呈均匀一致的淡黄染，管腔内药物结晶体呈黄棕褐色表达。

表3 各组大鼠成纤维细胞检测结果Tab.3 The determ ination resultof fibroblast in ratsof each group

4 讨论

慢性肾功能衰竭为内科危重病症，是由于多种慢性肾脏疾患发展到晚期，肾实质损害引起慢性肾功能严重损害，体内氮质及其代谢产物潴留，不能维持体内水、电解质及酸碱平衡而引起的各种临床综合征。其机制目前尚未完全清楚，对于CRF的治疗主要采用保守治疗和透析治疗、肾移植的替代疗法，由于替代疗法的治疗费用昂贵，尚难普及，因此中医药治疗CRF有着重要意义。CRF类似中医学的“水肿”、“癃闭”“虚劳”、“关格”、“溺毒”等症。根据 CRF发生发展病程中主要临床表现，笔者认为CRF的病机为内生和外来之毒侵蚀机体，引发脏腑阴阳失调，血瘀气滞，精血耗损，故自拟具有活血化瘀、益气养血、补肾健脾、利水排毒的大黄藿苓汤治疗，取得了较好的临床效果。近年研究发现，血小板源生长因子[3-4]参与小管、间质的损伤过程，并刺激间质成纤维细胞增殖和细胞外基质（ECM）的增多，促进肾小管萎缩、间质纤维化和小管周围毛细血管丧失的发生与发展。血小板源性生成因子（PDGF）体外实验可使成纤维细胞转变为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞较肾脏固有的成纤维细胞具有更强的纤维化功能，是肾纤维化及其他组织纤维化中细胞外基质沉积增多的主要原因之一。成纤维细胞生长因子广泛存在于多种组织中，能够以自分泌和旁分泌的方式促使系膜细胞增殖及其产生ECM，对成纤维细胞有很强的促分裂与刺激增生、趋化移行的作用。研究表明[3]bFGF可促进人肾成纤维细胞增殖、分泌Ⅰ型胶原增加。本实验研究表明大黄藿苓汤可减低CRF大鼠尿素氮、血肌酐、尿酸，减少肾组织的肾单位萎缩、消失、纤维组织增生面积，抑制慢性肾功能衰竭成纤维细胞生长因子bFGF的表达。说明大黄藿苓汤能改善慢性肾功能衰竭的临床症状，延缓病情的恶化，其机制可能是抑制慢性肾衰成纤维细胞生长因子bFGF的表达，进而抑制肾脏纤维组织化。

[1]周小舟,张盛光，阳 晓，等.腺嘌呤所致CRF大鼠的机理研究[J].基础医学与临床,1997，17(1)∶54-54.

[2]邓虹珠,金伟军，侯连兵，等.慢性肾功能衰竭药效学研究的设计和方法[J].中国中药杂志,1998,23(4):243-243.

[3]杨朝晖.细胞因子对肾间质纤维化形成的影响[J].中国现代医学杂志，2004，14（5）:17-18.

[4]EddyAA.Molecular insights into renal interstitial fibrosis[J].JAm Soc Nephrol,1996,7(12)：2495-2580.

[5]韦 颖，樊均明，潘丽萍，等.碱性成纤维细胞因子对人肾成纤维细胞的影响[J].中华肾病杂志，2002，18（2）：135-136.

Effectsof dahuang huoling decoction on the expression of bFGF in ratswith chronic renal failure

HANShun-ping1,YANGYou-xin1,YUANChao-sheng2,etal
（1.Tianjin University of TCM， Tianjin， China 300193； 2.The PLA 272Hospital， Tianjin 300020， China）

[Objection]To explore the protective function and ofDahuang Huoling decoction on ratswith chronic renal failure.[Methods]To establish the ratsmodelby using adenine,divide themodel rats into normalgroup,modelgroup,medicated group 1 andmedicated group 2.[Results]The pathology changesof themedicated group 1 and 2were lighter than thatof the controlgroup.Blood Urea Nitrogen(BUN),creatinine,uric acid and bFGFexpressionsofmedicated group 1 were lower than thatof themodelgroup(P<0.05).The bFGF expressions inmedicated group 2werenoobviously differentiation than that inmodelgroup(P>0.05).[Conclusion]Dahuang Huoling decoction had protective function on chronic renal failure of rat kidney caused by adenine.Earlymedication wasmore effective than later period.Itsmechanism can be the restraintin bFGFexpressions.

Dahuang Huoling decoction;adenine;CRF;bFGF

R285.5

A

1672-1519(2010)03-0245-03

天津市自然基金项目（003607811）。

韩顺平（1965-），男，硕士，助理研究员，主要从事中医治疗疑难病的临床和基础研究工作。

2010-01-10）