乙二胺四亚甲基膦酸钙预防性给药对卵巢切除大鼠骨质疏松的作用

李群力，陈 菲，麻佳蕾，汪 妍

(金华职业技术学院医学院药学教研室，浙江金华 321007)

目前，临床治疗骨质疏松症的药物主要有各种钙制剂、氟化物、维生素D类药物、二膦酸盐、雌激素和利尿药等，长期服用具有诱发肿瘤和恶心呕吐等不良反应。因此，寻找安全有效的治疗药物具有重要的社会意义与经济价值。乙二胺四亚甲基膦酸盐 (ethylenediamine tetramethylene phosphonate，EDTMP)是一种新型胺基大分子有机膦酸盐，对骨组织有很强的亲和力，能很快积聚在骨折以及骨小梁和皮质骨受破坏区域，有效抑制骨代谢失衡，从而增加骨形成;有效缓解骨交换中激化因子对痛觉神经的刺激作用，达到镇痛的目的。含有EDTMP的体内放射新药［153Sm］EDTMP于1997年上市，iv给药可缓解癌症骨转移疼痛，其在体内仅被骨组织大量吸收，在其他脏器及软组织中几乎不存留，且在体内不降解，以原型排出［1－3］。在常用的治疗骨质疏松的药物中，与EDTMP有相关性的药物是二膦酸制剂。EDTMP作为一个有机膦酸，与二膦酸类分子的生化作用以及对骨疾病的治疗有一定的相似性。但EDTMP与二膦酸盐不是同一个分子，与二膦酸盐有以下区别:①分子量大，不良反应小，临床使用可以静脉推注，而二膦酸盐只能缓慢点滴;②与体内血浆蛋白等分子不结合，没有进入骨细胞的药物分子几乎是全部以药物原型从尿中排出，二膦酸分子有一部分与蛋白结合;③对于破骨细胞活性的抑制可能是通过对成骨细胞干扰来完成的，而不是直接作用于破骨细胞;④能抑制局部区域导致增生性成骨细胞的过度活性;⑤与二膦酸相比，对金属具有较强的络合能力，可以直接将钙离子螯合，带到钙流失较大的病灶部位。但EDTMP是一个很强的络合配体，进入动物体内能迅速与血液中的钙、镁离子螯合，造成钙、镁离子水平急剧下降，使机体无法维持正常的血管紧张程度和心脏正常的起搏功能。Ca-EDTMP是将钙离子与EDTMP螯合，使药物螯合性大大降低，从而使毒性明显低于不含钙的EDTMP。目前关于 EDTMP，国内尚无相关研究报道，国外有一项专利申请［4］。本研究采用切除卵巢方法建立大鼠骨质疏松症模型，研究Ca-EDTMP预防性给药治疗骨质疏松症的效果，以期为开发疗效确切、不良反应较少的防治骨质疏松的新药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

EDTMP冻干粉针，每支70 mg，Ca-EDTMP含量92.5%，由金华职业技术学院自制;阳性对照药氯膦酸二钠(clodronate disodium)，广州明兴制药厂生产，批号070703;戊巴比妥钠，上海科丰化学试剂有限公司生产。

1.2 仪器

Hologic骨密度测定仪(美国Hologic公司);钙试剂盒(卫生部上海生物制品研究所)，磷试剂盒(上海捷门生物技术公司)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)试剂盒(上海科欣生物技术研究所);马弗炉(上海浦东跃欣科学仪器厂);Autograph Shimadzu生物力学测定仪(日本岛津);722S分光光度计(上海科学精密仪器有限公司)。

1.3 Ca-EDTMP的制备与结构确证

Ca-EDTMP的制备是将亚膦酸、盐酸和乙二胺盐酸盐加热回流，滴加甲醛溶液，10 h后析晶，干燥得EDTMP粗品，以浓氨水溶解粗品，加盐酸回流，析晶，干燥得EDTMP精品。EDTMP精制品以水为溶媒，搅拌下逐渐加入Ca(OH)2，直至溶液澄清，滤过，冻干，即得Ca-EDTMP冻干粉针。对Ca-EDTMP的结构确证研究采用元素分析、红外、核磁共振、质谱和紫外等方法，着重研究Ca-EDTMP的化学结构;总钙量的测定以《中国药典》2005版二部附录ⅣD原子吸收分光光度法第二法(标准加入法)规定的方法，以基准碳酸钙溶液为标准溶液(6.25 mg·L－1)，钙空心阴极灯为光源，在422.7 nm依法测定;采用紫外分光光度法测定酸性、碱性条件下Ca-EDTMP溶液中游离钙离子的浓度，确证EDTMP与钙在不同pH条件下的络合稳定性。结果显示，当溶液在pH 7.5～8.5时，EDTMP能与钙形成稳定的络合物，检测不到游离的钙。钙总量以基准碳酸钙标准溶液计算标示量为99.6%，按照Ca-EDTMP干燥品计为5.0%。且能确证Ca-EDTMP的结构。

1.4 动物、模型的制备及分组

SD大鼠，♀，体重190～210 g;中科院上海实验动物中心提供，合格证:中科动管委第005号。

80只随机分组，分为假手术组、模型对照组、Ca-EDTMP 2，4，8，16，32 mg·kg－1组和氯膦酸二钠组，每组10只。大鼠用3%戊巴比妥钠麻醉，常规消毒。除假手术组打开腹腔后缝合外，其他各组大鼠在无菌条件下双侧去除卵巢，将输卵管结扎。手术后第4天开始给药，Ca-EDTMP iv给予，每4周1次，共4次，每4周称取体重1次，根据体重调整给药量。根据氯膦酸二钠的临床应用剂量，成人(以60 kg 计)3.2 g·d－1，选定氯屈膦酸二钠 50 mg·kg－1，每日 po，连续 120 d。末次给药后 1 周处死动物，进行指标检测。

1.5 血清Ca、P水平和碱性磷酸酶活性的检测

收集全血分离血清，－20℃保存，按照试剂盒说明测定血清中Ca，P水平和ALP活性。Ca的含量用甲基麝香草酚蓝法测定，P的含量用紫外法测定，ALP的活性用2-氨基-2-甲基-1-丙醇法测定。

1.6 大鼠骨骨密度的测定

取大鼠右侧股骨置于有机玻璃板上用Hologic骨密度测定仪测定股骨密度。

1.7 骨组织中Ca和P含量的测定

取大鼠左侧股骨，称重后于110℃烘干1 h，再置于马弗炉内200，400，600和800℃各灰化2 h。灰化结束，冷却称重，用 HCl 6 mol·L－1溶解，采用1.5中的方法测定骨组织中Ca和P含量。

1.8 生物力学指标的测定

将大鼠右股骨置于Shimadzu生物力学测定仪上进行股骨三点弯曲实验加载速度5 mm·min－1，跨距10 min。记录弹性模量(kg·mm－3)，最大载荷(N)，最大挠度(mm)，弹性压力(kg·mm－3)和弹性应变(%)数值。

1.9 病理学检查

大鼠股骨骨头用3%硝酸脱钙作石蜡切片，HE染色，病理检查股骨骨小梁的变化。

1.10实验结果数据以±s表示。采用SPSS 10.0统计软件中t检验进行组间比较。

2 结果

2.1 Ca-EDTMP对卵巢切除大鼠血清Ca，P水平和ALP活性的影响

表1结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠血清Ca水平变化不大，但血清P水平明显增加(P＜0.05)，ALP 活性明显增加(P ＜0.05)。与模型组比较，Ca-EDTMP组血清Ca在正常范围内波动，而血清 P水平明显下降(P ＜0.05，P ＜0.01)，ALP 活性明显下降(P＜0.05，P＜0.01)。氯膦酸二钠也可降低血清P水平和 ALP活性(P＜0.01)，其影响与Ca-EDTMP基本一致。

表1 乙二胺四亚甲基膦酸钙(Ca-EDTMP)对卵巢切除大鼠血清Ca，P水平及碱性磷酸酶(ALP)活性的影响Tab.1 Effect of calcium ethylenediamine tetramethylene phosphonate(Ca-EDTMP)on Ca and P contents and alkaline phosphatase(ALP)activity in ovariectomized rats

2.2 Ca-EDTMP对卵巢切除大鼠股骨骨密度和骨组织中Ca及P含量的影响

表2结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠股骨骨密度降低(P＜0.05);骨组织中Ca及P的含量也降低(P＜0.01)。与模型组比较，Ca-EDTMP 2和4 mg·kg－1组能提高卵巢切除大鼠股骨骨密度，但无统计学差异;Ca-EDTMP 8，16 和32 mg·kg－1明显提高卵巢切除大鼠股骨骨密度(P ＜0.05，P ＜0.01)，并有一定的量效关系相关系数为0.965;除 Ca-EDTMP 2 mg·kg－1组无明显影响外，其他 Ca-EDTMP 组骨组织中Ca及P的含量均明显增加，且呈剂量相关性(相关系数为0.972，P ＜0.05，P ＜0.01)。氯膦酸二钠也能明显提高大鼠股骨骨密度(P＜0.01)，并明显增加骨组织Ca及P的含量(P＜0.01)。

2.3Ca-EDTMP对卵巢切除大鼠股骨生物力学参数的影响

表3结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠股骨弹性模量、最大载荷、最大挠度、弹性应力和弹性应变均明显降低，其中最大载荷下降32.3%(P＜0.01)，弹性应变下降22.1%。与模型组比较，Ca-EDTMP各组最大载荷分别增加了23.9%，27.2%，28.7%，45.7% 和37.2%(P ＜0.01)，氯膦酸二钠组最大载荷增加了33.4%(P＜0.01);Ca-EDTMP 8，16 和 32 mg·kg－1组弹性变化分别增加了44.8%，9.2%和45.2%(P ＜0.05)。

表2Ca-EDTMP对卵巢切除大鼠股骨骨密度(BMD)和骨组织中Ca及P含量的影响Tab.2 Effect of Ca-EDTMP on femur bone mineral density(BMD)and contents of Ca and P in ovariectomized rats

表3 Ca-EDTMP对卵巢切除大鼠股骨生物力学参数的影响Tab.3 Effect of Ca-EDTMP on biomechanic properties of femur in ovariectomized rats

2.4Ca-EDTMP对卵巢切除大鼠股骨头骨小梁的影响

图1结果显示，假手术组(图1A)骨膜清晰，骨密质细胞层次丰富，厚度正常，骨松质区域见骨小梁丰富，小梁间见较丰富的骨髓组织。模型组(图1B)见骨密质较薄，细胞含量少，骨小梁细长，小梁间空隙明显增大，少见骨髓成分。Ca-EDTMP 8 mg·kg－1组(图 1C)骨密质厚度尚正常，可见少量腔隙生成，骨松质中骨小梁细长，排列较松散，骨髓含量较少。Ca-EDTMP 16 mg·kg－1组(图1D)骨密质厚度正常，骨松质中小梁较稀疏，骨髓含量不丰富。Ca-EDTMP 32 mg·kg－1组(图1E)骨密质厚度正常，细胞层次较清晰，骨小梁增宽，相互联结，骨髓较丰富。阳性氯膦酸二钠组(图1F)骨密质形态正常，骨松质所含比例正常，骨小梁宽，小梁间骨髓组织丰富。

3 讨论

本研究阳性对照药选用氯膦酸二钠，未采用目前治疗骨质疏松症的骨治疗剂阿仑膦酸钠(二膦酸盐)，是考虑到阿仑膦酸钠口服吸收较低，胃肠道反应大，其服用方法和时间严格规定为:每天早上第一次进食或给予其他药物治疗之前至少30 min，白开水送服，不能卧位服药，服药后需避免躺卧并保持活动至少30 min，以确保药片进入胃内。在作为对照药应用时，其效果和应用的方便性反而不及氯膦酸二钠。

图1 Ca-EDTMP对卵巢切除大鼠股骨头骨小梁结构的影响 (HE ×115).分组处理见表1.A:假手术组;B:模型组;C:Ca-EDTMP 8 mg·kg－1组;D:Ca-EDTMP 16 mg·kg－1组;E:Ca-EDTMP 32 mg·kg－1组;F:氯膦酸二钠 50 mg·kg－1组.Fig.1 Effect of Ca-EDTMP on trabecula structure of femur in ovariectomized rats(HE ×115).

本研究结果发现，切除双侧卵巢后，大鼠股骨密度降低，血清P水平和ALP活性明显增加，骨组织中Ca及P的含量也较低，弹性模量、最大载荷、最大挠度、弹性应力和弹性应变均明显下降。股骨头骨密质较薄，细胞含量少，骨小梁细长，小梁间空隙明显增大，少见骨髓成分，说明模型成立，其他文献也有相同报道［5－6］。

评价骨质疏松症疗效的主要指标是骨密度的上升。本实验结果显示，给予Ca-EDTMP治疗后，明显提高卵巢切除大鼠股骨骨密度，并有一定的量效关系。

防治骨质疏松症的主要目的之一是防治骨折的发生，因此，骨的生物力学指标是评价药物疗效的又一重要指标［7］。本实验中切除卵巢后大鼠股骨弹性模量、最大载荷、最大挠度、弹性应力和弹性应变均明显降低，给予Ca-EDTMP治疗后以上生物力学指标均有提高，尤其是最大载荷和弹性应变明显增加。

生化指标的变化反映体内骨代谢平衡的变化，可用来评价骨转换率，客观地反映骨吸收和骨形成情况［8］。切除卵巢后大鼠血清中 Ca水平变化不大，P水平上升，ALP活性增加。给药后可以降低血清P水平和ALP活性，表明Ca-EDTMP可有效抑制卵巢切除大鼠的骨量丢失。

正常骨小梁骨膜清晰，骨密质细胞层次丰富，厚度正常，模型组大鼠骨小梁骨密质较薄，细胞含量少，骨小梁细长。给予Ca-EDTMP治疗后，随剂量增加大鼠骨密质厚度增加，细胞层次清晰，骨小梁增宽，相互联结，骨髓较丰富。显示Ca-EDTMP对改善大鼠骨松质中骨小梁形态有明显作用，Ca-EDTMP 32 mg·kg－1组与假手术组骨质基本一致。

本研究结果显示，在卵巢切除大鼠骨质疏松症模型中，Ca-EDTMP能增加股骨骨密度，增加股骨Ca及P含量，降低血清中P水平及ALP活性，使股骨的最大载荷、最大挠度、弹性应变增强，表明其在防治骨质疏松症上有防止骨量的丢失，抑制骨吸收的作用，且呈剂量相关性。

本研究是手术后第4天给药，属于预防性给药，因而对于骨质疏松症的临床治疗效果还有待于延长给药时间进一步来验证。

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