灯盏花素联合缬沙坦治疗2型糖尿病大鼠的疗效观察＊

刘华 兰海涛 刘红 郑倩 陈武宁

(川北医学院生理学教研室,四川 南充 637100)

最新糖尿病流行病学调查结果标明,中国糖尿病患病人数已经超过9200万,成为世界上糖尿病患者最多的国家,而且还在呈快速增长趋势[1]。糖尿病患者中90%以上是2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM),所以,对 T2DM 病理机制和防治进行研究,具有重要的临床和社会价值。结合我国实际,采用价廉有效的中草药结合部分西药,用于糖尿病及其并发症的防治,是近年来国内临床与科研工作者积极探索的一种新模式。根据糖尿病的病理损害机制,防治应以降糖降脂、改善循环功能及保护肾功能为主[2]。采用Bre联合缬沙坦治疗糖尿病模型大鼠,研究其对T2DM大鼠,特别是肾脏功能的保护作用及机制,目前还未见有文献报道。灯盏花素(Breviscapine,Bre)是从灯盏花中分离出的一类黄酮类成分,主要含灯盏乙素、少量灯盏甲素和其它黄酮成分。大量研究表明,黄酮类化合物具有降低血脂、抗炎、调节免疫、抗氧化等作用[3]。有文献报道,Bre能够使糖尿病患者和糖尿病肾病大鼠的尿蛋白减少,减轻肾脏肥大[4]。缬沙坦是血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂,能够降低血压,改善机体血液循环。本实验以高糖高脂饮食加小剂量STZ腹腔注射诱发的T2DM大鼠为研究对象,给予12 w Bre联合缬沙坦治疗,探索该治疗方案对T2DM大鼠肾功能的影响及作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器

链脲佐菌素(STZ,Sigma),血糖、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及钠钾-ATP酶检测试剂盒(南京建成生物公司),胰岛素放射免疫检测试剂盒(北京北方生物技术研究所),灯盏花素(云南龙峰药业公司),缬沙坦(海南皇隆制药厂)。快速血糖测定仪(三诺SXT-1型,长沙)。

1.1.2 动物及饲料

3月龄雄性 Wistar大鼠,一级,体质量(195±16)g。常规饲料：57%碳水化合物,22%蛋白质,6%脂肪,8%纤维素,7%其它成分。高能饲料(60%常规饲料,20%蔗糖,15%猪油,5%胆固醇)。动物及饲料均由四川省医学科学院实验动物研究所提供,动物合格证号：SCXK(川)2004-15。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立与分组

T2DM大鼠模型建立参照本实验室以前的方法[5],4w高能饲料喂养,空腹12 h后给予25 mg◦kg-1的STZ一次性尾静脉注射,继续高能饲料喂养4 W,然后采尾静脉血测定空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(FINS),并计算胰岛素敏感指数(ISI)[6],最后选取符合T2DM条件的20只大鼠作为模型,其余淘汰。实验动物设立三组：正常对照组(A);模型对照组(B);治疗组(C)。参照文献[7,8],缬沙坦与Bre各 20 mg◦kg-1◦d-1。缬沙坦用蒸馏水配成1%浓度灌胃,每日1次,Bre腹腔注射,上下午各1次,每次10 mg◦kg-1。对照组每次等量蒸馏水灌胃和注射。治疗期间,全部大鼠都用常规饲料喂养,自由饮水。实验动物于治疗12 w末空腹12 h,然后从心脏采血制备血浆和血清标本-70℃保存待测,断髓处死动物,摘取右侧肾脏,去包膜后用滤纸吸干水分称重,将右肾质量与体质量之比作为肾脏肥大指数(KW/BW)。左侧肾脏取其皮质液氮保存用于钠钾-A TP酶活性测定。

1.2.2 生化及放免检测

血糖采用快速血糖测定仪测定,TG、TC、SOD和MDA的检测严格按照说明书操作,采用751分光光度计,FINS测定采用放射免疫分析法。

1.2.3 肾皮质钠钾-ATP酶活性测定

取每只实验大鼠0.3 g肾皮质置于玻璃皿中,加入9倍体积的冷生理盐水,在冰浴条件下剪碎并匀浆处理,取10%匀浆4000 rpm离心15min,取上清液用定磷法按试剂盒说明书测定,样品中总蛋白含量用考马斯亮兰法测定。钠钾-ATP酶活性以每毫克肾皮质组织总蛋白中钠钾-ATP酶每小时分解ATP产生的无机磷(Pi)的量表示(μ mol◦mg-1protein◦hr-1)。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS10.0软件行双侧t检验和单因素方差分析,计量结果均以±sd表示,以P＜0.05作为统计学检验标准。

2 结果

2.1 大鼠的一般症状和体征变化

与正常对照组大鼠比较,建立的T2DM模型大鼠体重明显增加,并出现腹型肥胖和多饮,多食,多尿的症状,毛发色泽黯淡,精神萎靡,活动减少,随着病程延长,除大鼠体重呈下降趋势外,其它症状逐渐加重;与模型对照组大鼠比较,Bre联合缬沙坦治疗12 w后,上述症状体征得到明显改善。

2.2 大鼠血糖血脂和肾脏肥大指数的变化

表1可见,与正常对照组比较,糖尿病模型对照组大鼠FBG、TC、TG水平显著升高(P＜0.01),KW/BW 显著增大(P＜0.05);与模型对照组比较,治疗组大鼠12 w后,FBG、TC、TG水平显著下降(P＜0.01),KW/BW 显著降低(P＜0.05)。

表1 实验大鼠血清FBG、TC、TG和肾脏肥大指数的变化(d,n=10)

表1 实验大鼠血清FBG、TC、TG和肾脏肥大指数的变化(d,n=10)

注：aP ＜0.05,bP＜0.01,与A组比较

组别 FBG(mmol◦L-1)TG(mmol◦L-1)TC(mmol◦L-1)KW/BW(×10-3)A 6.07±0.44 1.14±0.23 1.95±0.37 3.14±0.26 B 16.35±3.42b 3.38±0.96b 3.52±0.67b 4.62±0.43a C 11.36±0.88b 1.75±0.42b 2.54±0.46b 3.68±0.33a

2.3 药物治疗对实验大鼠血浆SOD、M DA水平的影响

表2可见,与正常对照组比较,糖尿病模型对照组大鼠血浆SOD水平显著降低(P＜0.01),MDA水平显著升高(P＜0.01);与模型对照组比较,治疗组12 w后,大鼠血浆SOD水平显著升高(P＜0.01),M DA水平显著降低(P＜0.01)。±sd,n=10)

表2 实验大鼠血浆SOD与MDA水平的变化(）

表2 实验大鼠血浆SOD与MDA水平的变化(）

注：aP ＜0.01,与 A 组比较

组别 SOD(U◦ml-1) MDA(mmol◦L-1)A 120.28±23.34 4.64±1.16 B 85.53±16.82a 18.66±4.48a C 107.61±18.65a 8.93±2.24a

2.4 实验大鼠血清胰岛素和胰岛素敏感指数的变化

表3可见,与正常对照组比较,糖尿病模型对照组大鼠血清FINS水平显著升高(P＜0.01),ISI显著降低(P＜0.05);与糖尿病模型对照组比较,药物治疗12 w后,大鼠血清FINS水平显著降低(P＜0.05),ISI显著升高(P＜0.05)。

表3 药物治疗对实验大鼠血清FINS、ISI和肾皮质钠钾-ATP酶活性的影响(d,n=10)

表3 药物治疗对实验大鼠血清FINS、ISI和肾皮质钠钾-ATP酶活性的影响(d,n=10)

注：aP ＜0.05,bP＜0.01,与A组比较

组别 FINS(mIU◦L-1) ISI 钠泵活性(μ mol Pi◦mg-1 ◦h-1)A 15.75±4.12 -4.16±0.22 2.68±0.54 B 22.41±5.45b -5.81±0.43a 1.72±0.21b C 18.56±4.82a -4.71±0.35a 2.28±0.34b

2.5 药物治疗对糖尿病大鼠肾皮质钠泵活性的影响

与正常对照组比较,12 w后模型对照组大鼠肾皮质钠钾-ATP酶活性显著降低(P＜0.01);与糖尿病模型对照组比较,治疗组12 w后,肾皮质钠钾-ATP酶活性显著升高(P＜0.01),见表3。

3 讨论

糖尿病是由于胰岛素或其受体缺乏引起的以高血糖为特征的慢性代谢性疾病。T2DM主要是通过长期的高血糖高血脂对循环系统造成损伤,诱发机体细胞产生胰岛素抵抗,血脂异常还可能是糖尿病肾病的重要危险因素之一。研究表明,灯盏花素具有抗炎、调节免疫、降低血脂,改善肾脏微循环等作用[3]。实验结果显示,糖尿病大鼠经12 w治疗后,FBG、TC和TG水平显著降低,胰岛素敏感性显著升高,多饮多食多尿和精神活动下降的症状得到显著改善,说明该组药物对T2DM模型大鼠具有明显疗效。

据报道,高血糖可与SOD活性中心的赖氨酸结合,产生糖化反应,使SOD活性下降,抑制自由基的清除[9]。氧自由基通过攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,并因此形成脂质过氧化物,如MDA、酮基、羟基等,进而引起细胞代谢及功能障碍。因此,本实验通过测定大鼠血浆SOD和MDA水平,了解动物体内氧化与抗氧化能力。实验结果显示疾病模型大鼠氧化能力增强,而抗氧化能力减弱,同时也表明Bre联合缬沙坦治疗能够提高糖尿病大鼠机体的抗氧化能力,这与既往文献报道Bre能够清除氧自由基,提高机体抗氧化能力一致。而且,这两种药物联合使用,比本实验以往单纯使用Bre对T2DM的降糖降脂效果更显著。

缬沙坦是血管紧张素Ⅱ受体(AT1)的特异拮抗剂,可以有效抑制血管收缩和醛固酮的释放,同时降低肾皮质转化生长因子(TGFβ1)及其Ⅱ型受体mRNA 的表达,扩张肾脏血管,改善局部血液循环;还能降低血肌苷和血尿素氮水平,减轻肾脏肥大,抑制细胞外基质积聚,延缓DN的发展[10]。实验通过检测肾脏肥大指数和肾皮质钠钾-ATP酶的活性,了解药物对肾脏结构和功能的保护作用。实验结果显示糖尿病大鼠12 w时,肾脏结构和功能已经发生显著改变,治疗组的结构表明该方案对T2DM大鼠肾脏形态结构,特别是功能蛋白具有显著的保护作用。

总之,灯盏花素联合缬沙坦对T2DM大鼠肾脏结构和功能具有显著保护作用,其机制可能主要是通过降低糖尿病大鼠血糖血脂,减少组织炎症反应,提高动物机体抗氧化能力和扩张血管,降低血压,改善肾脏组织血液循环有关。

1 Yang W,Lu J,Weng J,et al.Prevalence of Diabetes among Men and Women in China[J].N Engl J M ed,2010,362(12)：1090-1101.

2 王文娟.糖尿病及常见并发症[J].新医学,2004,35(1)：8-11.

3 黄爱玲.黄酮类化合物药理作用研究进展[J].安徽农学通报,2007,13(10)：71-72.

4 Chenval L,Doucet A.M easurement of Na+-K+-AT Pase-mediated rubidium influx in single segments of rat nephron[J].Am J Phy siol,1990,259(1)：F111-121.

5 刘红,罗蕾,高原.2型糖尿病大鼠近球小管 Na+,K+-AT Pase活性变化[J].第三军医大学学报,2006,28(20)：2062-2064.

6 李光伟,潘孝仁,Lillioja,等.检测人群胰岛素敏感性的一项新指数[J].中华内科杂志,1993,32(10)：656-660.

7 赵珉,吴永贵,林辉,等.灯盏花素对糖尿病大鼠肝肾组织氧化应激的影响[J].中国病理生理杂志,2005,21(4)：802-807.

8 施辉,罗镧,张定武,等.缬沙坦对糖尿病大鼠一氧化氮及肾脏转化生长因子β1水平的影响[J].南通大学学报(医学版),2007,27(4)：240-242.

9 杨兰泽,高静,付建斌,等.NIDDM患者血清Lpo SOD NO和GHb检测及其临床意义[J].中国慢性病预防与控制,2000,8(3)：137-138.

10 郭志新,邱明才.氯沙坦对糖尿病大鼠肾脏转化生长因子p及其Ⅱ型受体表达的影响及机制[J].中国糖尿病杂志,2003,11(6)：421-422.