乳腺癌干细胞上皮-间质转化标志物表达变化及意义

孙正魁 马行天 唐 华 姚榛祥

乳腺癌干细胞能够发生侵袭、迁移,从而产生远处的转移病灶。对乳腺组织和乳腺癌标本的基因表达检测发现,CD44+CD24-/low的干细胞中间质细胞标志物呈高水平表达。我们采用乳腺癌干细胞体外模型,探讨乳腺癌干细胞的上皮-间质转化标志物表达、迁移及侵袭能力的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

人 MCF-7乳腺癌细胞系购自上海中国科学院细胞库,优级胎牛血清购自杭州四季青公司,DMEM和DMEM/F12培养基分别购自 Hyclone和 Gibco公司,EGF和 FGF购自 PeproTech公司,超低黏附 6孔培养板购自 Corning公司,CD24-PE和 CD44-FITC抗体购自 BD公司,鼠抗人 E-钙黏素(E-cadherin)、鼠抗人 N-钙黏素(N-cadherin)、鼠抗人纤维连接蛋白(Fibronectin)、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)、鼠抗人 β-actin单克隆抗体和 HR标记的兔抗鼠 Ig多抗购自 Santa cruz公司,Western blot增强放光试剂购自北京中山公司,Transwell小室和 Matrigel购自 BD公司。

1.2 方法

1.2.1 MCF-7细胞系中乳腺癌干细胞的分离培养和传代 取含血清培养基(为 DMEM培养基,添加了 5 U/L胰岛素和 10%的优级胎牛血清)中培养的处于对数生长期的 MCF-7细胞,用胰酶-EDTA消化成单细胞悬液。经台盼蓝染色并计数后重悬于干细胞培养基(在 DMEM/F12中添加 5 U/L胰岛素、20 U/L EGF和10 U/L bFGF)中,以 1×105个 /ml接种于超低黏附培养板,放入 37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中培养。当培养板中形成细胞球后,将其用胰酶-EDTA消化并机械吹打成单细胞悬液并重悬于干细胞培养基中,仍以 1×105个/ml的浓度接种于超低黏附培养板中。连续传代至 5代以上。

1.2.2 乳腺癌干细胞的有血清诱导分化 将培养出的第 5代细胞球用 PBS液冲洗后,用胰酶-EDTA消化成单细胞悬液,重悬于含血清培养基中,单细胞按照 1×105个/孔接种于 6孔板。每天用倒置相差显微镜观察其分化和生长情况。当细胞贴壁、分化并处于对数生长期时在含血清培养基中连续传代。

1.2.3 乳腺癌干细胞鉴定 取亲本 MCF-7细胞、第 5代 MCF-7微球体细胞、微球体细胞分化培养后传代到第 3代的 MCF-7细胞,每组细胞 5复孔,均经胰酶-EDTA消化成单细胞悬液后,取 5×105的单细胞均以20μl/m l的浓度加入 CD24-PE和 CD44-FITC抗体进行标记,避光 20min后用 PBS液洗 2遍,1%的多聚甲醛重悬,FACSCalibur流式细胞仪检测。取细胞球在SSM中贴壁分化的细胞至第 3代细胞,采用同样的方法检测分化后 CD44+CD 24-细胞含量。

1.2.4 Western blot检测 E-钙黏素 、N-钙黏素 、纤维连接蛋白、波形蛋白的表达 收集转染亲本 MCF-7细胞、第 5代 MCF-7微球体细胞、微球体细胞分化培养后传代到第 3代的 MCF-7细胞,每组细胞数为 5×105,用去污剂裂解缓冲液[50 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0),150mmol/LNaCl,1 g/L SDS,100 mg/LPMSF,1 mg/L Aprotinin,10 g/LNP-40]裂解细胞,提取总蛋白。紫外吸收法进行蛋白定量,调整浓度至 4 g/L。取25μl总蛋白,80 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转移至 PVDF膜,按蛋白质分子质量 Marker将 PVDF膜剪开,按次序分别用一抗(鼠抗人 E钙黏素、鼠抗人 N钙黏素、鼠抗人纤维连接蛋白、鼠抗人波形蛋白、鼠抗人 β-actin)和二抗(兔抗鼠 IgG-HRP)孵育膜。最后将膜与 Western blot发光试剂作用,X线胶片曝光,显影、定影,扫描入计算机,应用 SigmaGel软件分析相对积分光密度。实验重复 3次。以目的基因的积分光密度/β-actin的积分光密度值为相对光密度值,然后再以亲本 MCF-7细胞的相对光密度值为 1,计算 MCF-7微球体细胞、分化的 MCF-7细胞的 E-钙黏素、N-钙黏素、纤维连接蛋白和波形蛋白相对表达量。

1.2.5 肿瘤细胞迁移和侵袭实验 细胞迁移实验采用带 12μmol/L孔聚碳酸酯膜的 Transwell小室,下室内加入含血清培养基 200μl,上室内分别加入各组细胞 1×104及无血清培养基(为 DMEM培养基,添加了5 U/L胰岛素)200μl,每组细胞 5复孔。细胞侵袭实验预先用 Matrigel包被 Transwell小室的聚碳酸酯膜,其它步骤同细胞迁移实验。Transwell小室放入 37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中孵育 48 h后取出,切下聚碳酸酯膜,将滤膜底部用 4℃丙酮固定 5 m in,苏木精染色。在显微镜 20倍物镜视野下计数随机 5个视野的细胞数。

1.3 统计学处理

采用 SPSS 16.0统计软件进行统计分析。组间比较采用 One-Way ANOVA法,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCF-7在无血清悬浮培养下形成能够连续传代的细胞球

把 MCF-7细胞接种于超低黏附培养板的干细胞培养基中,在不同时间点用倒置相差显微镜观察 MCF-7细胞生长情况。24 h后,开始形成少量的细胞球,但仍有部分细胞贴壁。72 h后,产生大量的悬浮细胞球,细胞球体积明显增大,基本没有贴壁细胞。将细胞球用胰酶-EDTA消化后并传代,在用 SFM中可反复形成细胞球。用 SSM常规培养的 MCF-7细胞在 24 h后全部贴壁,48 h后形成单层细胞,有少量的悬浮细胞,但没有细胞球形成,见图 1。

2.2 MCF-7细胞球在有血清的培养基中贴壁分化

将获得的细胞球细胞接种于含血清培养基中,48 h后,部分细胞贴壁,仍有大量的悬浮细胞球。72 h后,细胞贴壁并与周围细胞融合,细胞形态在显微镜下与在 SSM中常规培养的 MCF-7细胞无明显区别,见图1。

图1 3组细胞显微镜下代表性图片

2.3 MCF-7细胞球中 CD44+CD24-细胞的含量

正常 SSM中培养与用微球细胞分化培养的细胞中 CD44+CD 24-细胞的含量无显著差异,分别为(2.16±0.33)%和(2.85±0.69)%。而微球体细胞中CD44+CD24-细胞的含量显著增高,为(76.01±4.67)%,与其它 2组比较,差异均有统计学意义,P均＜0.01,3组细胞流式细胞仪检测图见图 2。

图2 3组细胞流式细胞仪检测图

2.4 MCF-7细胞球细胞上皮和间质标志物的表达

MCF-7微球细胞中 E-钙黏素表达水平下调,与亲本 MCF-7和分化后的 MCF-7细胞比较,差异均具有统计学意义,P均 ＜0.01;而 N-钙黏素、纤维连接蛋白、波形蛋白的表达水平上调,与亲本 MCF-7和分化后的MCF-7细胞比较,差异均具有统计学意义,P均 ＜0.05,见图 3、图 4。

图3 3组细胞上皮及间质标志物表达变化

图4 3组细胞上皮及间质标志物电泳图

2.5 MCF-7细胞球细胞的迁移和侵袭能力

Transwell小室穿膜实验是检测肿瘤迁移、侵袭能力的体外模型,由图 5可见,本研究中 MCF-7微球体细胞的迁移和侵袭能力显著增强,与亲本 MCF-7和分化后的 MCF-7细胞比较,微球体细胞穿过聚碳酸酯膜和 Matrigel包被的聚碳酸酯膜的能力均显著增强,差异均具有统计学意义,P均 ＜0.05。

图5 3组细胞的迁移和侵袭能力比较

3 讨论

研究显示肿瘤组织及肿瘤细胞系中的细胞存在着不同分化阶段的细胞,其中有一小部分的肿瘤细胞充当干细胞的角色,在启动肿瘤形成和维持肿瘤生长中起决定性作用,被命名为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)。2003年 Al-Hajj等[1]在转移性乳腺癌中分离和鉴定出 CD44+/CD24-/lineage-的乳腺癌细胞群,这群细胞只需 200个就可以在 NOD/SCID鼠中形成肿瘤,而分选出该细胞群后的剩余的其它细胞无致瘤性,证实了乳腺癌干细胞的存在。随后的研究发现早期乳腺癌患者的骨髓标本存在表达 CD44+CD24-的乳腺癌干细胞,其比例为 33%～l00%,而原发肿瘤中CD44+CD24-细胞的比例不超过 10%,提示乳腺癌患者转移灶可能来自乳腺癌干细胞[2]。

上皮间质转化现象(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是 1种基本的生理现象,在胚胎发育过程中参与器官塑型。近年来研究发现,上皮间质转化在乳腺癌侵袭转移过程中也发挥了重要作用[3]。癌细胞发生上皮间质转化主要特征表现在 E-钙黏素的表达下调,上皮细胞间连接解体,细胞分散。同时 N-钙黏素、钙黏素 6、钙黏素 11等表达增强,形成细胞-基质黏附。以及间充质标志纤维连接蛋白、中间丝波形蛋白等表达上调,细胞骨架重排,细胞运动能力增强[4]。这样,癌细胞丢失上皮细胞特征、同时获得间质细胞的某些特性,游走能力提高、与周边或远处间质组织的亲和能力增强,进而造成远处转移。

已有研究表明,通过 EMT可使分化的乳腺上皮细胞获得了癌干细胞的特征[5,6]。对正常乳腺组织乳腺癌标本进行系列基因表达分析发现,CD44+CD24-/low干细胞高水平的表达间质细胞标志[6]。

我们根据 Pontid等[7]的描述,采用添加细胞因子的无血清悬浮培养法,成功从 MCF-7乳腺癌细胞中培养出乳腺微球细胞。该乳腺微球细胞在无血清培养基中能够连续传代。该微球体细胞在有血清培养基中进行分化培养,很快分化成贴壁的单层 MCF-7细胞。我们检测了第 5代细胞球的相关表面标志,发现该微球体细胞含量约为 76%的 CD44+/CD24-的乳腺癌干细胞。应用这种乳腺癌干细胞的体外模型,我们采用Western blot方法检测到 MCF-7微球体细胞 E-钙黏素表达下调,而 N-钙黏素、纤维连接蛋白、波形蛋白的表达上调,而 MCF-7微球体细胞分化后的 MCF-7细胞中E钙黏素、N钙黏素、纤维连接蛋白、波形蛋白的表达水平与亲本 MCF-7细胞比较无显著差别。我们的研究还发现,与亲本 MCF-7和分化后的 MCF-7细胞比较,MCF-7微球体细胞表现出显著增强的迁移和侵袭能力。说明乳腺癌细胞诱导培育产生乳腺癌干细胞过程中发生了EMT,可能是乳腺癌干细胞获得侵袭、转移能力的基础。因此,对乳腺癌干细胞与 EMT的关系的深入研究,可能为乳腺癌治疗提供新的方向。

[1] Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,etal.Prospective identifi cation of tumorigenic breast cancer cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:3983.

[2] Balic M,Lin H,Young L,et a1.Most ear1y dissem inated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype〔J〕.Clin Cancer Res,2006,12:5615.

[3] Briegel K J.Embryonic transcription factors in human breast cancer〔J〕.IUBMB Life,2006,58:123.

[4] Huber M A,Kraut N,Beug H.Molecular requirements for epithelial-mesenchymal transition during tumor progression〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2005,17:548.

[5] Morel AP,Lièvre M,Thomas C,et al.Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition〔J〕.Plos One,2008,3(8):e2888.

[6] Mani SA,Guo W,Liao MJ,et al.The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells〔J〕.Cell,2008,133(4):704.

[7] Pontid,Costa A,ZaffaroniN,eta1.Isolation and in vitro p ropagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties〔J〕.Cancer Res,2005,65:5506.