叶下珠总多酚提取工艺的优选

冀德富，郭东艳，裴妙荣

（1.山西中医学院，山西 太原 030024； 2.陕西中医学院，陕西 咸阳 712046）

叶下珠（Phyllanthus Urinaria L.）为大戟科叶下珠属植物叶下珠的干燥全草，在我国有着悠久的药用历史。现代药理研究证明叶下珠具有抗乙肝病毒（HBV）、保肝等作用［1］。 在临床上以叶下珠为君药或主要药物组成的复方如肝丹、肝康等治疗急慢性乙型病毒性肝炎效果显著［2-3］。国内外有关叶下珠化学成分的研究已证实其含有生物碱、黄酮、多酚和鞣质等成分，其中多酚和可水解鞣质是叶下珠的主要活性部位之一［4］。本课题组对叶下珠总多酚提取物进行了药理作用研究，结果亦表明多酚类成分是叶下珠治疗急慢性乙型肝炎的药效部位之一。以期为后续的树脂纯化工艺及其相关中药复方新制剂的研究奠定良好基础，本实验对叶下珠总多酚的提取工艺进行了优化选择。

1 实验材料

1.1 实验仪器

UV-2500型紫外可见分光光度仪（上海天美科学仪器有限公司），十万分之一电子天平 （瑞士：GB204型），RE-2型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 药品与试剂

没食子酸对照品（由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号：110831-200302），醋酸、甲醇、丙酮等均为分析纯；磷钼钨酸试液（称取钨酸钠10 g，钼酸钠2.5 g，加水70 mL使溶解；加盐酸10 mL，磷酸5 mL，加热回流10 h，放冷；再加硫酸锂15 g，水5 mL和溴0.2 mL，煮沸除去残留的溴，约15 min，冷却；加水稀释至 100 mL，滤过，即得）；大孔树脂HPD100（沧州宝恩化工有限公司）；叶下珠购自于西安市药材公司，经陕西中医学院药学院制药工程实验中心郭东艳老师鉴定为大戟科叶下珠属植物叶下珠的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 总多酚的含量测定［5］

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品10.1 mg，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 标准曲线的绘制 精密量取没食子酸对照品溶液 1.0 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、4.0 mL，分别置于25 mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1 mL，再分别加水 11 mL、10 mL、9.5 mL、9 mL、8 mL，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀。以相应的试剂为空白，照分光光度法（《中国药典》2005年版一部，附录VA）30 min后在760 nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，没食子酸含量C为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：A=0.0045+0.0054C，r=0.9996，结果表明：没食子酸在 40.4 μg～161.6 μg之间呈良好线性关系。

2.2 叶下珠总多酚提取工艺的优化

经预实验表明，大孔树脂纯化叶下珠总多酚效果较好，因此本实验在研究叶下珠总多酚的提取工艺时，考虑了不同提取溶剂对树脂纯化的影响，并以此作为选择提取溶剂的重要因素。

2.2.1 提取溶剂的选择 精密称定叶下珠2份，每份20 g，分别加入水、50%乙醇200 mL，浸泡0.5 h；加热回流提取2次，每次1 h；滤过，残渣用少量溶媒洗涤，合并提取液及洗涤液，并用相同溶剂定容至500 mL量瓶中，摇匀。精密量取提取液适量，显色，测定提取液中总多酚的含量，计算药材的总多酚提取率。结果表明，以水作为提取溶剂，叶下珠总多酚提取率为10.11%，以50%乙醇作为提取溶剂，总多酚提取率为9.88%，二者相比差异无统计学意义。因此将水提液和醇提液进行适当处理后加于已处理好的大孔吸附树脂柱上进行纯化，通过测定纯化后的固形物中总多酚含量和固形物收率（以药材计）来确定提取溶剂。

将水提液调整体积为每毫升相当于0.1 g药材；乙醇提取液回收乙醇，加水稀释至每毫升相当于0.1 g药材，放置至室温，冷藏 24 h，离心 15 min（4500 r/min），取上清液，备用。将两种药液100 mL分别加于已处理好的10 g大孔树脂柱上进行吸附，先以4 BV的纯化水水洗除杂，然后以5 BV的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥，测定固形物中总多酚含量和固形物收率（以药材计），结果见表1。

表1 大孔树脂纯化叶下珠药液实验结果

由表1可以看出，水提液过大孔树脂柱后固形物中总多酚含量偏低，说明水提工艺提取的杂质多，除杂困难；醇提液经处理后上大孔树脂柱效果较好（固形物中总多酚含量＞50%），因此，选一定浓度的乙醇为提取溶剂。

2.2.2 醇提正交试验 本文采用正交试验优选醇提工艺条件，选择乙醇浓度（A）、溶媒用量（B）、提取时间（C）和提取次数（D）为考察因素，以总多酚提取率为考察指标，设计三个水平，根据因素水平表（见表2），设计 L9（34）正交试验。

称取叶下珠9份，每份10 g，按照正交表试验方案进行提取，滤过，合并提取液，用相同溶剂定容至500 mL量瓶中，摇匀；精密量取1 mL，显色，测定样品溶液中总多酚的含量，计算药材的总多酚提取率，结果见表3，方差分析见表4。

表2 因素水平表

表3 正交试验方案及结果

表4 正交试验方差分析表

由表4可知，各因素对实验结果影响的重要性依次为D>B>A>C，由此得出的最佳工艺为A1B3C2D3。因素D即提取次数对总多酚提取率的影响有统计学意义，其余因素对实验结果的影响无统计学意义。考虑到工业生产的实际，本实验选取A1B2C2D3即10倍量的50%乙醇提取3次，每次1 h，作为叶下珠总多酚的最佳提取工艺条件。

2.2.3 重复性试验 按优化选取的

工艺条件重复实验3次，测得药材中总多酚的含量分别为10.37%、10.42%和10.18%，平均值为10.32%。验证结果与正交试验结果基本吻合，说明正交试验筛选出的提取工艺条件合理可行、重现性好。

3 讨 论

在确定提取效果的考察指标方面，我们没有采用单一指标成分的含量，而以叶下珠总多酚的含量作为考察指标，原因在于叶下珠所含的多酚类成分为其抗乙肝的药效部位，用单一成分做考察指标，尽管能够准确反映单个成分的提取效果，却不能反映所有多酚类成分的真实提取情况，故本研究以叶下珠总多酚作为提取工艺的考察指标，更能反映其抗乙肝有效部位的提取情况。

植物多酚的定量方法中较为普遍使用的有普鲁士蓝法、高锰酸钾法、酒石酸亚铁法等，本研究选用了2005年版《中国药典》中的磷钼钨酸-29%碳酸钠显色体系显色测定总多酚，溶液体系均一，工作曲线线性良好，样品显色稳定，故选之。

本研究在优化叶下珠总多酚的提取工艺时，考虑了提取溶剂对后续树脂纯化的影响，因此选择用适宜浓度的乙醇进行提取。正交试验结果表明乙醇浓度越高，提得的多酚类成分越少，本文选择50%乙醇作提取溶剂。乙醇用量对试验结果的影响不显著，结合生产实际确定用10倍量的溶媒。加热时间若较长会对多酚类成分有所破坏，根据试验结果确定提取时间为1 h。提取次数对试验结果的影响具有统计学意义，故选择提取3次，即叶下珠总多酚的最佳提取工艺为10倍量的50%乙醇提取3次，每次1 h。对该工艺进行重复性验证实验，稳定性较理想，便于后续的树脂纯化及相关新制剂研究的开展。

［1］窦志华.叶下珠属植物抗乙肝病毒的国内研究概况［J］.中成药，1998，20（3）：46-47.

［2］罗上武，王岭，王金志，等.肝丹治疗慢性乙型肝炎的药效学研究［J］.中国新药杂志，1999，8（12）：807-810.

［3］王岭，罗上武，张均倡，等.肝康治疗慢性乙型肝炎抗HBV作用研究［J］.中西医结合肝病杂志，1999，9（4）：14-15.

［4］张芝英.高效液相色谱法测定叶下珠中没食子酸的含量［J］.中国药业，2002，11（7）：53.

［5］国家药典委员会.中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录57.