番茄红素对大鼠缺血再灌注脑组织损伤的干预作用

毛旭娟,张俊峰,梁建芳,郑绘霞

(1.山西医科大学,山西 太原 030001;2.山西体育职业学院,山西 太原 030006;3.山西医科大学第一医院,山西 太原 030001)

番茄红素(lycopene)是目前已知最有效的抗氧化活性物质,具有极强的清除自由基能力,在抗癌、预防心脑血管疾病、提高免疫力、延缓衰老等方面有很好的功效。近年来的研究表明,番茄红素可以通过消除自由基、增强机体组织抗氧化能力等作用,达到保护组织器官的目的。脑缺血再灌注的损伤机制虽然目前不是十分明确,但发生氧化损伤、细胞膜的破坏是大多数研究已经证实的。本实验借助大鼠脑缺血再灌注模型(MCAO),通过观察番茄红素对大鼠脑组织基质金属蛋白酶-9(Metalloproteinase-9,MMP-9)的表达、脑含水量的影响,来研究探讨番茄红素在脑缺血再灌注损伤中的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂及设备

雌性 Wistar大鼠 22只,体重230 g～330 g,购于山西医科大学生理实验室。适应性喂养 1周,随机分为三组:假手术组(sham组)6只,缺血再灌注组(IR组)8只,番茄红素组(LP组)8只。实验造模完成,动物苏醒后参考 Longa5分评分法,2分或 2分以上者入选本实验,2分以下者剔除。所有手术组大鼠经取脑证实有明确梗塞灶者,被最终确认入选实验分析,否则弃去所有数据,补充动物。番茄红素(北京威创康比特公司),MMP-9抗体(北京博奥森生物技术有限公司)SABC染色试剂盒、DAB显示试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 动物模型制作方法

线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO),缺血2 h后再灌注。基本步骤:大鼠于手术前12 h禁食,随意进水;称重后,用 10%水合氯醛(4m L/kg)腹腔麻醉;剪去颈前部手术区毛发,消毒皮肤并于颈部行25mm常规纵行切口,暴露并钝性分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA);结扎 ECA与 CCA,用动脉夹夹闭 ICA远心端;迅速于 ECA与ICA分叉下方剪一切口,将一预先用酒精灯烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉,去除动脉夹,插入深度为(18±0.5)mm,直到有轻微阻力感为止,实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处,尼龙线外留约1 cm,将庆大霉素注射于伤口处,全层缝合伤口。2 h后轻轻提拉所留线头至 CCA,由对侧颈动脉系统、基底动脉经过 Willis共同维持损伤侧颈内动脉、大脑中动脉的血液供应,实现大脑中动脉再灌注,造模完成。

1.3 给药方法

LP组于术前给番茄红素7.2mg/(kg◦d)灌胃 1周[1],最后一次灌胃后30 min进行实验操作。IR组缺血2 h再灌注22 h,术前等量生理盐水灌胃 1周;sham组只结扎颈内动脉和颈外动脉,不插入线,其他操作与IR组相同。

1.4 取材和指标的检测

大鼠脑缺血2 h再灌注22 h,用10%水合氯醛深度麻醉动物后开胸暴露心脏,经升主动脉插管剪开右心耳,用生理盐水250m L快速冲洗,断头取脑,在4%多聚甲醛中固定6 h。用免疫组织化学法检测脑组织MMP-9。免疫组织化学染色法严格按照说明书实验步骤进行,采用 BI-2000医学图像分析系统分析平均光密度质,每张随机取 5个视野,计算阳性细胞数。取平均值作为统计参数。

1.5 脑组织含水量测定

采用干湿重法。大鼠于缺血再灌注后,滤纸吸干脑组织表面水份,在电子天平上称得其湿重后即刻置于烤箱,100℃恒温烘烤24 h至恒重,精确称量干重,计算含水量。脑组织含水量 =(湿重 -干重)/湿重 ×100%。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 免疫组化法脑组织 MMP-9表达(见表 1)

表1 各组 MMP-9的阳性细胞数及平均光密度质(±s)

表1 各组 MMP-9的阳性细胞数及平均光密度质(±s)

注:*IR组 、LP组各指标与sham组比较均P＜0.05,#LP组与 IR组阳性细胞数比较P＜0.05,△平均光密度质比较P＜0.05

组别 n 阳性细胞数 平均光密度质sham组 6 0 0 IR组 8 18.25±7.38* 0.366±0.011*LP组 8 9.88±2.10*# 0.242±0.010*△

表1对各组的阳性细胞数研究显示,LP组和 IR组脑组织 MMP-9表达明显,与 sham阳性细胞数比较P＜0.05。LP组与 IR组比较,MMP-9的阳性细胞数减少(P＜0.05);平均光密度质明显降低(P＜0.05)。

2.2 番茄红素对缺血再灌注后大鼠脑含水量的影响(见表 2)

表2 各组大鼠脑含水量比较(±s) %

表2 各组大鼠脑含水量比较(±s) %

注:*IR组、LP组与sham组比较均P＜0.05,#LP组与IR组比较P＜0.05

组别 n 脑含水量sham组 6 76.63±1.20 IR组 8 81.73±1.19*LP组 8 78.56±1.17*#

表2结果显示,IR组、LP组与 sham组比较差异有统计学意义,均(P＜0.05)。LP组与 IR组比较差异有统计学意义(P＜0.05),表明番茄红素能明显减少脑缺血再灌注大鼠的脑含水量。

3 讨论

MMPs是分解细胞外基质(ECM)的蛋白酶类中最重要的一类。其中 MMP-9又称基质溶素-9,是基质金属蛋白酶中的重要成员,与脑血管病和血脑屏障的完整性密切相关。研究证实,在发生缺血再灌注损伤后,缺血脑组织中 MMP-9表达会明显增高[2,3]。MMP-9损伤血脑屏障后可以引起血管源性脑水肿,从而脑组织发生重要的病理改变[4]。因此,干预 MMP-9的表达可以有效地减少缺血再灌注后脑组织的损伤。

番茄红素(lycopene)是具有极强的清除自由基能力的天然抗氧化剂,近年来的研究表明,番茄红素可以通过直接淬灭氧自由基、增强机体组织抗氧化能力等达到保护组织器官的作用。已有动物实验证实番茄红素有脑保护作用,其机制也与其清除自由基有关,可以减轻脑水肿的发生。有研究表明大鼠脑缺血再灌注后番茄红素可以减轻脑水肿,降低脑梗死体积,同时可抑制脑组织中丙二醛的产生。此外,番茄红素可抑制皮肤、肺和肝组织内的 MMP-9表达[5]。

抗氧化剂能否减轻脑缺血再灌注后脑组织损伤研究报道很少。本实验发现,番茄红素干预能使大鼠大脑中动脉缺血再灌注的脑组织中 MMP-9表达减少(均P＜0.05),脑含水量降低(P＜0.05),提示番茄红素能通过降低大鼠大脑中动脉缺血再灌注后缺血侧脑组织中 MMP-9的表达。特别是在血管源性脑水肿发生的高峰时期24 h～48 h之间,可以推测番茄红素可以通过抑制 MMP-9的产生从而减少脑水肿达到保护脑组织。番茄红素抑制 MMP-9活性的机制尚不清楚。可能由于 MMP-9基因结构中具有激活剂蛋白-1(AP-1)的结合位点,番茄红素可通过抑制核转移因子AP-1影响 MMP-9的活性。另有研究认为超氧化物歧化酶能减轻脑损伤后 MMP-9的表达[6],番茄红素的抗氧化剂清除自由基的作用可能是影响 MMP-9活性的另一原因。机体组织局部氧化应激发生时,自由基的产生增多都可以合并有 MMP-9表达的增加[7]。

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[5] 高元兴,秦华东.抗氧化剂在降低肝缺血再灌注损伤中的作用[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(5):911.

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[7] 吴 旻,李玉光.基质金属蛋白酶和氧化应激在大鼠动脉粥样硬化中的表达[J].中国心血管病研究杂志,2007,5(1):55-57.