远志对 A β 25-35诱导 AD模型大鼠海马区 NF-κ B活化研究

黄作义,许志刚,吴成吉,张晓梅,朱晓峰

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是发生于老年和老年前期,以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变,是老年期痴呆的最常见类型,约占老年期痴呆的50%。临床上表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间能力损害、抽象思维和计算能力损害、人格和行为的改变等。截止 2006年,全球痴呆患者约有 2430万(我国 500万 ),每年新发病例460万(我国 30万),且每年翻一番。各国调查趋势汇总显示,痴呆患病率在 2%～ 7%,女性多于男性[1]。N F-κB是一种广泛存在于真核细胞内可将信息从胞浆传至细胞核并引起相应基因表达的重要转录因子,活化后可调控众多细胞因子和炎症介质的基因表达,调节免疫反应,参与细胞内信号传递。远志是著名的益智药物,远志药草的命名就集中地体现了益智强记的主要功能,始载《神农本草经》,至今,中医临床实践已近两千年。本实验以海马区注射 A β25-35建立的 AD模型大鼠为研究对象,从 NF-κB活化角度探讨远志对 AD的防治作用。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级 Wistar大鼠 96只 ,雄性 ,体重 250～ 300g,由佳木斯大学医学实验动物中心提供,标准鼠饲料饲养。

1.2 实验药物

远志:由哈尔滨三九药业生产,1g相当于6g饮片。

1.3 主要试剂

A β 25-35(武汉博士德生物工程有限公司),NF-κBp65激活-核转运试剂盒 (碧云天生物技术研究所),兔抗大鼠 P-I κ B α抗体 (上海迪奥生物技术有限公司),兔抗大鼠 IκB α、SABC免疫组化检测试剂盒、DAB染色试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司)。

1.4 主要仪器

单臂脑立体定位仪(M P8000)(深圳瑞沃德生命科技有限公司);Morris水迷宫 (成都泰盟科技有限公司);荧光倒置显微镜(IBE2000)(重庆光电仪器有限公司)。

2 方法及检测指标

2.1 动物分组

将96只大鼠随机分为正常对照组,假手术组,模型组 ,远志低、中、高剂量组共6组,每组16只。

2.2 AD动物模型制备

将 A β 25-35肽段 lmg溶于0.5mL灭菌生理水中,浓度为 2 μg/μL,37℃恒温孵育一周,使其变为聚集态的 A β,放置于4℃冰箱备用。模型组,远志低、中、高剂量组以10%水合氯醛 (0.35mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠;麻醉成功后,立体定位仪固定头部,颅顶区备皮,常规消毒手术区皮肤。沿颅顶中线作 2cm切口,分离骨膜使头骨暴露,参照《大鼠脑立体定位图谱》,海马区定位坐标:于前囟向后3.0mm,中线左右各旁开2.0mm,用牙科钻钻开颅骨 ,垂直进微量进样器针2.8mm,将5μL溶液缓慢注入,留针5min,以保证溶液充分弥散,然后缓慢撤针,缝合切口皮肤,青霉素肌注8万单位 /次,连续肌注3d,假手术组手术方法相同,注射同体积的生理盐水。

2.3 给药方法

用开水按比例稀释成0.083g/mL,0.167g/mL,0.334g/mL低中高三个剂量组,4℃保存。各组大鼠均按1mL/100g·d。A β注射后第 7天开始灌胃给药 ,连续 4周。

2.4 各组大鼠海马区 NF-κB p65的活化

制作脑冠状石蜡切片,用免疫荧光法测定海马区 N F-κB p65核移位情况,所有操作严格按照碧云天生物技术研究所 N F-κ B激活-核转运试剂盒说明书进行。

2.5 各组大鼠海马区 P- IκB α、 I κ B α的表达

免疫组化步骤(SABC法),按试剂盒说明书操作步骤进行。

2.6 统计学分析

采用 SPSS13.0软件对数据进行单因素方差分析,以P＜0.05为显著性差异水平。统计阳性细胞数的计算取每只大鼠脑组织切片3张,每张切片于海马区随机选取5个区域,在400×显微镜下计算此区域内的免疫组化染色为阳性细胞数,将所得均数作为每只动物的阳性细胞数作为统计资料,结果以 (±s)表示。

3 结果

3.1 海马区 NF-κB p65的活化

N F-κ B p65呈红色荧光,细胞核呈蓝色荧光 ,如细胞核内出现粉色荧光则表示 N F-κ B进入核内为阳性细胞。与正常对照组相比,假手术组中 N F-κ B蛋白阳性细胞数无显著差异。与正常对照组和假手术组比较,其余各组 N F-κB蛋白阳性细胞数均显著增加 (P＜0.05)。与模型组比较 ,远志各剂量组中 NF-κB蛋白阳性细胞数均显著减少(P ＜0.05)。与远志低剂量组比较 ,远志中、高剂量组中 NF-κB蛋白阳性细胞数均显著减少 (P＜0.05)。与远志中剂量组比较,远志高剂量组中 N F-κ B蛋白阳性细胞数无显著差异。

3.2 海马区 P- IκB的表达

P-I κ B阳性细胞定位于细胞浆,呈棕黄色。与正常对照组和假手术组相比,模型组、远志低中剂量组 P-I κ B蛋白阳性细胞数均显著增加 (P＜0.05),远志高剂量组中 P- IκB蛋白阳性细胞数无显著差异。与模型组相比,远志低中高剂量组 P-I κ B蛋白阳性细胞数均显著降低 (P ＜0.05)。

3.3 海马区 I κ B的表达

Iκ B阳性细胞定位于细胞浆,呈棕黄色。与正常对照组和假手术组相比,其余各组 Iκ B蛋白阳性细胞数均显著降低(P ＜0.05)。与模型组相比,远志低、中、高剂量组, Iκ B蛋白阳性细胞数逐渐增加,远志高剂量组 Iκ B蛋白阳性细胞数显著增加 (P＜0.05),但仍低于正常对照组和假手术组(P ＜ 0.05)。

表1 各组对大鼠海马区 NF- κ B p65、P- Iκ B、 IκB阳性细胞数 [±s,例数(个)]

表1 各组对大鼠海马区 NF- κ B p65、P- Iκ B、 IκB阳性细胞数 [±s,例数(个)]

注:与正常对照组和假手术组相比*P＜0.05;与模型组相比#-P ＜0.05。

组别 N F- κ B p65 P- Iκ B α Iκ B正常对照组 7.88± 2.42 17.88±5.00 35.13±5.67假手术组 8.25± 1.91 19.75± 5.01 33.75±6.04模型组 41.38± 5.13* 51.75± 6.99* 13.88±3.23*远志低剂量组 32.63±4.96*# 38.00±4.44*# 15.25±2.71*远志中剂量组 19.88±4.40*# 25.13±5.36*# 17.38±3.11*远志高剂量组 22.13±4.46*# 24.50±3.74# 21.25±3.88*#

4 讨论

现代医学对阿尔茨海默病的病因和发病机制尚不明确,目前主要有β淀粉样蛋白级联学说、Tau蛋白学说、遗传因素学说、慢性炎症学说、氧化应激学说等。AD除了具有大脑皮质萎缩、神经元缺失、神经纤维缠结、老年斑等病理特征以外,还伴随着一个缓慢的炎症病理改变过程[2]。Bales等也研究发现,用 A β作用于原代培养的星形胶质细胞后,能以时间一剂量依赖型的方式激活 N F-κB,并通过激活的 N F-κ B上调 IL- lβ和 IL-6的表达。在 AD病人脑组织切片的免疫组化分析中发现 NF-κ Bp65处于活化形式并且在神经元及星型胶质细胞中处于激活状态,这些 NF-κB激活的细胞仅局限于老年斑的附近[3]。NF-κ B是一种广泛存在于真核细胞内可将信息从胞浆传至细胞核并引起相应基因表达的重要转录因子。没有外界刺激时,N F-κB在胞质中与其 NF-κB抑制蛋白( IκB)结合,呈不具活性的状态。许多刺激因子均可使 NF-κB活化,在这些因子的作用下,I κ B激酶(IKK)激活,使 I κ B磷酸化,泛素化,降解,从而使 NF-κB活化。NF-κB活化后其 p65亚基上的 NLS暴露,使活化的 NF-κB转移入胞核,并与 DN A的 κ B反应元件结合,从而调节特异基因的转录表达。而由于 I κ B a启动子含有 κ B结合的位点, IκB a的转录受到 NF κB的调节,活化的 N F κ B能够上调 IκBa mNRA水平 ,新合成的 IκBa进入核内与 NF κ B结合 ,使其从DN A上解离下来 (NF κ B与 IκB蛋白的亲和力高于其与DN A的亲和力), IκBa分子中的核输出序列 N ES(nuclear export signal)再促使 N F κB重新回到细胞质中[4]。远志是自古以来的益智良药,因此国内学者用各种 AD模型从行为学研究、抗氧化、清除自由基、抗炎的作用,对神经细胞的护作用及对中枢胆碱能系统的影响等方面对远志的益智作用进行了相关研究。

通过实验研究表明,远志能够抑制 AD模型大鼠海马区N F κB活化,这种作用主要是通过抑制 IκB a降解而不是通过刺激 IκBa蛋白合成增加来实现的。远志减轻 IκB a磷酸化的机理还需进一步探讨。

[1]贾建平.神经病学 [M].第6版.北京:人民卫生出版社,2008,214-219

[2]Fiala M,Zhang I,Can X.Amyloid-beta induces chemokine secretion and monocyte migration across a human blood-brain barrer mode[J].Mol Med,1998,4(7):480-489

[3]Bales KR,Du Y,Dodel RC,et al.The NF-kB/Rel family of protei-ns mediates A-beta-induced neurotoxicity and glial activation[J].Brain Res Mol Brain.Res,1998,57(1):63-72

[4]Tak PP,Firestein GS.NF-kappa B:a key role in inflammatory diseases[J].J Clin Invest,2001,107(l):7-11