羊膜移植术治疗兔角膜碱烧伤治疗的实验研究

林玉华,曹丽辉,刘远光

(佳木斯大学附属第一医院眼科,黑龙江 佳木斯 154003)

近年来随着羊膜移植(Amniotic membrane transplantation,AM T)研究的不断深入,许多研究者发现羊膜是一种透明、有一定韧性且无神经、血管和淋巴管的组织。羊膜有抗原性低,促进眼表上皮化,减轻炎症反应、减少新生血管形成的作用。最近的研究发现细胞因子在角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成中发挥至关重要的作用,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)已经被证实是 CNV的生长因子之一。羊膜有抗原性低,促进眼表上皮化,减轻炎症反应、减少新生血管形成的作用。用羊膜修复眼角膜和角膜缺损区的创面可提供一个理想的基底膜,使其迅速上皮化及创口愈合。证实了 AM TT治疗角膜碱烧伤等眼表疾病所致的角膜溃疡具有良好的疗效。可促进角膜上皮化,抑制炎症和新生血管,减轻纤维化。目前认为,单纯 AM T对角膜内皮功能受损较轻的Ⅲ度烧伤效果较好,术后大部分角膜透明或仅留薄翳,很少有新生血管长入;对炎症等原因导致内皮功能不正常的,AM T有助于其功能的恢复,但对角膜内皮损伤较重,内皮失代偿的,单纯 AM T效果较差,因此对于Ⅳ度烧伤特别是合并溃疡和穿孔的,可以将 AM T作为重建眼表的第一步,虽不能恢复有用的视力但可以保存眼球,防止病情的进一步恶化,改善眼表微环境,为后期重建健康的眼表功能创造机会。但有关这些作用的生物学基础尚不完全清楚。本实验的目的在于观察羊膜移植术对兔角膜碱烧伤后面积和透明度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

选择健康新西兰大白兔(佳木斯大学动物中心提供)48只。新鲜羊膜组织(购自妇婴医院 )。眼科手术显微镜,纤维器械,裂隙灯显微镜(苏州医疗器械厂 )。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组

健康成年兔 48只(雌雄不分),体重 2.5～ 3.5kg(由佳木斯大学动物实验室提供)。随机分为 4组,每组 12只。

1.2.2 动物模型的建立

新鲜羊膜的制备:取 HBsAg、衣原体、人体免疫缺陷病毒及梅毒均阴性的健康孕妇产后所获得的胎盘。取材均在无菌操作下完成。用无菌生理盐水冲洗干净,置于青霉素 5×104u/L,链霉素 5×104u/L及二性霉素 B 2.5mg/L的生理盐水中浸泡 10min,钝性剥离,使羊膜与绒毛膜分离。将羊膜粗糙面与纸的粗糙面相贴,上皮面向上平铺于粘贴手术巾的纸片上,附有羊膜纸片剪成 20mm×20mm大小,置于含青霉素100000u/L,链霉素 100000u/L的 DMEM培养基中,4℃冰箱中保存,备 12h内应用。

兔角膜碱烧伤模型的制作:将实验兔按 1mL/kg体重在耳缘静脉注射氯氨酮全麻药后,固定于兔架上。将直径15mm的滤纸浸于 1mol/L的氢氧化钠溶液中 20秒钟,在瓶口处沾干,放置在已点表面麻醉药地卡因的兔右眼角膜中央3min后,除去滤纸 ,迅速用生理盐水冲洗结膜囊 20min。

A组(对照组):制作模型后不给予羊膜移植治疗。只用葡萄糖溶液 100mL冲洗结膜囊,然后点托吡卡胺散瞳,点氯霉素眼药水,结膜囊内涂红霉素眼膏,连续治疗 3d。

B组于碱烧伤后 1h行羊膜移植术治疗,用滤纸吸干结膜囊内水分,新鲜羊膜上皮面向下贴附于角膜,尽量做到紧密,间断缝合八 8～ 10针 ,将羊膜固定于浅层巩膜。术后滴抗生素眼液,涂眼膏,滴散瞳剂减轻炎症反应。

C组于碱烧伤后 24h行羊膜移植治疗,手术方法同前,术后滴抗生素眼液,涂眼膏,滴散瞳剂减轻炎症反应。

D组于碱烧伤后 48h行羊膜移植术,手术方法同前,术后滴抗生素眼液,涂眼膏,滴散瞳剂减轻炎症反应。

1.2.2 角膜着染面积观察

10%荧光素钠溶液进行角膜染色来判断角膜上皮修复情况:根据着色面积分为 FI(+++ ),着色面积直径 7～10mm;FI(++),着色面积直径 5～ 7mm;FI(+),着色面积直径为 3～ 5mm;FI(±),面积小于 3mm的浅着色。

1.2.3 角膜透明度观察

根据资料标准并结合本研究的具体情况,制定如下分级标准:Ⅰ度:角膜完全透明。Ⅱ度:角膜轻度混浊,透过该区角膜尚可辨认虹膜纹理。Ⅲ度:角膜混浊,透过该区角膜不能辨认虹膜纹理,但可模糊辨认瞳孔缘。Ⅳ度:角膜混浊,虹膜及瞳孔缘不能视见。

1.2.4 HE法染色

第 3周角膜烧伤区炎症反应,B组较 A组为轻,B组角膜烧伤区上皮呈病理性愈合,上皮增生活跃 ,但不均匀,细胞排列不规则,胶原性纤维排列紊乱,以前 1/3基质为著,纤维母细胞增多。后部基质的胶原纤维板层排列尚属正常,无角膜细胞增多现象。相比之下,A组烧伤区角膜不但上皮未能修复,胶原纤维板层紊乱程度亦较显著。C组较 B组为轻,角膜上皮愈合完整,胶原纤维板层排列稍欠规则,混浊区角膜上皮修复完全,但不规则,部分前弹力层缺损区上皮层较薄,胶原纤维层紊乱较透明区明显,浅基质层内纤维母细胞增多。

1.3 统计方法

应用完全随机设计多个样本比较的 Kruskal-Wallis H检验对数据进行处理,以P＜0.05为差异有显著意义。

2 结果

表 1 角膜染色面积比较(角膜个数,n=96)

表 2 角膜透明度观察(角膜个数,n=96)

3 讨论

进行角膜荧光素染色面积和角膜透明度观察并分别将标本常规 HE染色。羊膜移植术组(C组)无论在炎症反应,角膜荧光素钠着染面积和透明度方面的治疗效果都优于和对照组 (B组 ,A组,D组 )。

用羊膜修复眼角膜和角膜缺损区的创面可提供一个理想的基底膜,使其迅速上皮化及创口愈合[1]。证实了 AM T治疗角膜碱烧伤等眼表疾病所致的角膜溃疡具有良好的疗效。证实了 AM T可促进角膜上皮化,抑制炎症和新生血管,减轻纤维化[2]。目前认为单纯 AM T对角膜内皮功能受损较轻的三度烧伤效果较好,术后大部分角膜透明或仅留薄翳,很少有新生血管长入;对炎症等原因导致内皮功能不正常的,AM T有助于其功能的恢复,但对角膜内皮损伤较重,内皮失代偿的,单纯 AM T效果较差,因此对于四度烧伤特别是合并溃疡和穿孔的,可以将 AMT作为重建眼表的第一步,虽不能恢复有用的视力但可以保存眼球,防止病情的进一步恶化,改善眼表微环境,为后期重建健康的眼表功能创造机会。

羊膜具有:基底膜作用[3],羊膜可产生多种生长因子,如:成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子-β(TGF-β)[4]等,有利于上皮细胞分化移行,增强上皮细胞粘附性,调节结膜上皮转化为角膜型上皮细胞,并可作为支架组织部分替代角膜基质;羊膜可以治疗化学伤自身免疫时引发的角膜自溶。羊膜移植术及硅胶粉作为一种新的方法治疗角膜酸烧伤,较传统治疗方法更有效。此方法既可以减少有害物质的存留又可以提供角膜大量营养成份、抗炎成份、角膜上皮修复的支架,可较好的提高患者视力,是一种经济、简捷、有效的方法。

[1]Huang AJ,Tseng SC,Kenyon KR.Paracellular permeability of corneal and conjunctival epithelia[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1989,30(4):684

[2]Ormerod LD,Garsd A,Reddy CV,et al.Dynamics of corneal epithelial healing after an alkali burn.A statistical analysis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1989,30(8):1784

[3]Shimazaki J,Shinozaki N,and Tsubota K.Transplantation of amniotic membrane and limbal autograft for patients with recurrent pterygium associated with symblepharon[J].Br J Ophthalmol,1998,82(3):235-240

[4]刘春民,徐锦堂.转化生长因子β1对角膜碱烧伤后机体免疫细胞功能的影响 [J].眼科研究,2000,18(4):101-103