植物防御素的生物学活性及其应用前景

杨树维，冯娟*，任正隆

（电子科技大学生命科学与技术学院，成都，四川，610054）

通过自身产生抗菌肽来防御微生物的侵害，是生物先天免疫的重要组成部分，这种古老的防御机制广泛存在于微生物，节肢动物，植物和动物中。抗菌肽中一个极为重要的大家族统称为防御素，这些多肽首先发现于兔子的巨噬细胞和粒细胞中［1,2,3］，随后在果蝇中也发现了防御素［4,5］，之后的研究表明防御素广泛存在于自然界中。事实上，防御素这个大家族中的分子在结构和功能上具有惊人的保守性，它们已经从两大生物界中被鉴定出来，而且至少被划分为五类。前三类防御素发现于哺乳动物和鸟类中［6,7,8］，第四类和第五类防御素发现于昆虫和植物中［9］，同时这些分子的代表也见于软体动物和真菌中。

植物防御素因其在结构和功能上与之前在昆虫和哺乳动物中发现的防御素抗菌肽相似而得名。目前的研究表明，植物防御素是植物先天免疫系统的重要组成部分，它们普遍存在于各种植物中，并且各类植物防御素的代表也从多种多样的植物中不断被发现。

1 植物防御素的结构

植物防御素的编码区域主要可以划分为两个部分，一个是信号肽区域，它引导多肽分泌到胞外空间，另一个是成熟肽区域，此外有些种类开花植物的防御素还存在一个碳末端结构域。

植物防御素通常含有45～54个氨基酸残基，其中包括8个半胱氨酸残基，分子量约为5.0 kD。通过对各种材料植物防御素的氨基酸序列进行比对，发现它们除了8个保守的半胱氨基酸残基外，其余位置的氨基酸残基均非常不保守，具有较低的同源性。不过植物防御素的高级结构非常相似，Rs-AFP1的核磁共振结果表明，该多肽以一个致密的球形结构存在，其中包括3个反平行β-折叠片层和1个α-螺旋，8个保守的半胱氨酸残基形成了4对二硫键从而稳定了这一结构［10］。Kobayashi等人发现位于α-螺旋中的第21位Cys和25位Cys与位于第三β-折叠片层中的第45位Cys和47位Cys形成了两对二硫键，对于维持该结构发挥了关键作用［11］，Cornet等人将其命名为Cys稳定的α-螺旋、β-折叠结构模序，简称CSαβ［12］。

2 植物防御素的体外活性

2.1 酶抑制剂活性

2.1.1 α-淀粉酶抑制剂

Bloch和Richardson等人首先证实了植物防御素具有抑制昆虫α-淀粉酶的活性［13］，名为SIα1,SIα2和SIα3的3种多肽，均对昆虫消化酶α-淀粉酶表现出特异性的抑制，并且对真菌和人唾液淀粉酶具有弱的抑制活性，而其对于来自猪胰腺，大麦和细菌的α-淀粉酶无抑制活性。由于一些植物防御素具有抑制昆虫内脏α-淀粉酶的活性，因此暗示了植物防御素在植物抗虫害方面发挥着重要作用，即很可能植物防御素是通过降低昆虫对淀粉的消化能力的方式来发挥其杀虫作用的。

Lin等人研究发现β-转角3（Loop3）对于植物防御素α-淀粉酶抑制剂活性的发挥起着重要的作用，在随后的研究中发现同样是来源于绿豆种子中的植物防御素VrD2，虽然具有与VrD1极其相似的结构，但是并没有对黄粉甲虫α-淀粉酶的抑制活性，于是他们对VrD1和VrD2进行了结构和表面电荷性质的比对，发现VrD1在第二β-折叠（β2）和第三β-折叠（β3）之间有一个较长的β-转角（Loop3），相比之下VrD2则较短，同时先前其与黄粉甲虫α-淀粉酶（TMA）分子对接结果显示，Loop3能够插入到TMA的活性位点，从而影响酶活性中心与底物的相互作用。Loop3中Arg等带正电荷的氨基酸残基被认为与酶活性位点氢键的形成有关。随后它们通过基于结构的蛋白质工程手段对VrD2进行了改造，用VrD1的Loop3取代了VrD2中相应的部分，并且发现由此得到的重组VrD2具有与VrD1相似的TMA抑制活性。这项研究充分说明电荷性质和转角的长度是影响植物防御素α-淀粉酶抑制剂活性的关键因素。事实上，不同来源α-淀粉酶催化位点空间立体结构的差异也是影响植物防御素α-淀粉酶抑制剂活性的重要因素。

2.1.2 蛋白酶抑制剂

研究人员从一种杀虫植物猪肠豆（Cassia fistula ）中分离出来两种植物防御素，其中名为5459的多肽表现出对胰蛋白酶的抑制活性，相反另外一种多肽5144则无该活性。5459与5144的区别仅仅在于为数不多的几个氨基酸残基的差异，研究证实第25位氨基酸残基由Thr到Lys的替换与酶抑制剂活性密切相关［14］。

已经有人提出，植物防御素是通过抑制昆虫消化功能的方式来实现其杀虫效果的［15］。Vulgarin和WCB- AFP两种植物防御素均表现出对胰蛋白酶消化的耐受性，尽管它们对于胰蛋白酶的抑制活性没有得到检验，但是这种抗蛋白酶消化的特性从一方面暗示了它们的蛋白酶抑制剂活性。总之，有关植物防御素发挥蛋白酶抑制剂活性的机制仍有待于进一步的研究。

2.2 抗微生物活性

早在20世纪90年代，Terras等人首次发现了植物防御素的抗菌活性［16］。植物防御素的抗微生物活性主要表现在抗真菌上，而对一些革兰氏阳性菌也存在抑制作用，不过其抑制作用较真菌偏弱。

Br-AFP2（一种抗真菌肽）在52μgmL-1的浓度下对巨大芽孢杆菌（B.megaterium）具有抑制作用［17］，从菠菜中分离得到的防御素在低于20μM（IC50）的浓度下对马铃薯环腐病菌（C.Michiganensis）和青枯病菌（P.solanacearum）具有抑制作用［18］。WCBAFP分别在125,101,86μM(IC50)的浓度下对B.Megaterium, 枯草芽胞杆菌（B.Subtilis）, 草分支杆菌（M.Phlei）具有抑制作用。与真菌相反，植物防御素对细菌生长抑制的作用机制仍然不清楚，将来对于植物防御素受体的研究是解释其抗细菌作用机制的关键所在。

植物防御素能够抑制真菌类微生物的生长，这些真菌包括：黑曲霉（Aspergillus niger）、粉色面包霉菌（Neurospora crassa）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；还包括许多真菌性病原菌，如：灰霉菌（Botrytis cinerea）、球孢枝孢菌（C.Sphaerospermum）、菜豆炭疽病菌（Colletotrichum lindemuthianum）、大刀镰孢菌（Fusariumculmorum）等。值得注意的是，植物防御素对于真菌的抑菌活性和抑菌浓度与真菌的种类和植物防御素本身的特性有关。例如，Ah-AMP1对于植物病原体大刀镰孢菌（Fusari um culmorum）的半抑制浓度（IC50）为12μgmL-1，而 Rs-AFP2对该菌的IC50仅仅为1.512μgmL-1，TvD1能够在100μgmL-1的浓度下对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）产生抑制作用，而BSD1对该菌的IC50可以达到500μgmL-1以上［19］。更为有趣的是，经植物防御素处理后的真菌，其显微镜分析发现并非所有的防御素对真菌的生长均产生相同的效果，而是出现两种截然不同的效果，由此可以将植物防御素分成两类。第一类以Rs-AFP1,Rs-AFP2和Hs-AFP1为代表，定名为形态发生防御素，因为它们不但抑制真菌的生长，而且还诱导其菌丝体形态发生变化。特别是在这类防御素存在的情况下，真菌的菌丝体出现分支，膨胀和缩短等变化；第二类包括Dm-AMP1, Dm-AMP2, Ah-AMP1和Ct-AMP1, 归为非形态发生防御素［20,21］。

总之，抗菌肽的高级结构呈现出两亲性的排列，具有一个带正电荷的亲水表面。已经有人提出，抗菌肽和靶微生物相互作用的首要条件是碱性的多肽与微生物表面相反电荷静电相互作用的引发，在静电相互作用产生之后，抗菌肽的疏水性区域通过疏水相互作用插入到膜结构中，因而在金属阳离子存在的情况下，金属离子竞争性地与膜受体结合，从而引起起始静电相互作用的减弱，最终导致多肽抑菌活性的降低［22,23］。与此同时，Oard 和Karki［24］提出一种与竞争模型不同的机制，他们认为金属阳离子的存在会对抗菌肽β-purothionin的结构产生影响，使其结构朝不利于发挥生物活性的方向变化。

2.3 哺乳动物细胞活性

植物防御素对哺乳动物细胞活性的研究，最早集中在对人脐静脉内皮细胞以及肌肉和皮肤组织成纤维母细胞生长力的检测上，此外还检测了这些多肽对人红细胞的溶解作用。只有当这些细胞与浓度低于500 μgmL-1的Rs-AFP1和Rs-AFP2孵育时才出现生长力降低的变化，而其他植物防御素并无明显作用效果。早已经有报道，WCBAFP对鼠脾脏细胞的有丝分裂具有促进作用，然而研究人员也发现该植物防御素并不能诱导鼠腹膜中巨噬细胞NO的产生［25］。此外，RBAFP和PBAFP也具有促进细胞有丝分裂的活性［26］。

3 生物技术应用前景

植物防御素所表现出来的生物学活性，使其受到生物技术领域的广泛关注，这些特性包括抗微生物活性，杀虫活性，甚至还有抗寄生植物活性。正是因为这些特性使得植物防御素成为蛋白质工程和植物抗病虫害基因工程优良的候选材料。此外，有些植物防御素不仅仅对一种真菌起作用，而是对多种植物真菌病原体都有抑制活性，这是其生物技术应用的又一大优势, 例如从萝卜（Raphanus sativus）中提取的植物防御素Rs-AFP2就对多种真菌具有抑制活性，其浓度变化范围从1到3μgmL-1［16］，因而植物防御素这些特性对于R基因介导的植物转化具有非常明显的优势。除此之外，植物防御素还能够与其他的抗菌化合物共同作用，有助于植株抗性的增强［27,28］，最终植物防御素可能带来植株除抗微生物活性之外对于非生物胁迫的适应。

近十年来，过去将杀菌肽作为一种新型治疗药物的想法被重新点燃，杀菌肽所表现出的一些活性引起研究人员的注意。这些活性包括⑴广泛的抗菌谱，包括病毒、细菌、真菌、原生动物，甚至肿瘤细胞；⑵所需剂量低和快速的杀菌效果；⑶与其他杀菌肽和临床治疗药物的协同作用；⑷具有使肉毒素失活的活性，因而有助于防止败血性休克；⑸它们的作用靶点主要是细胞质膜，因此不大可能产生耐药性。⑹它们通常对哺乳动物细胞的毒性低。⑺一些杀菌肽具有调节哺乳动物先天免疫的能力，从而开辟了一种新的治疗手段［29,30］。不过，目前在将植物防御素作为治疗剂方面仍然存在许多理论和技术上的问题，不过欣慰的是科学家们正在努力地解决这些难题。

已经证实，通过转基因的手段将植物防御素基因重组到植物的基因组中，可以使植物体组织产生对于病原体的抗性。目前已有多种防御素基因导入植株中以增加植株抗性,并检测到了已表达的植物防御素蛋白及其抗菌活性，如烟草、马铃薯、水稻、拟南芥、油菜和哈密瓜等。Terras等人将一种萝卜种子防御素Rs2AFP2的基因转入烟草中，其表达量可达叶片总蛋白的0.2% ,明显增强了植株对于小叶病源真菌烟草赤星病菌（Alternaria longipes）的抗性［31］，之后又有研究人员将其应用于番茄上，并且获得了类似的结果［32］。一种豌豆防御素在甘蓝型油菜（Brassica napus）中组成型表达能够增强其对于黑胫病的抗性［33］。此外，Gao等人［34］将从苜蓿（Medicagosativa）种子中分离到的防御素alfAFP的基因在马铃薯中表达，抗菌结果显示转基因马铃薯增强了对大丽花轮枝孢菌( Verticillium dahliae) 的抗性,并且在田间种植情况下仍能保持很好的抗菌活性。近年来国内在植物防御素转基因研究中也取得了一些成功，王贺一等人通过根癌农杆菌介导的方法成功地将白芥防御素基因转入甘蓝型油菜中，获得了抗卡那霉素的再生转基因植株，不过转基因植株的遗传稳定性有待于进一步的研究［35］，随后又有研究人员通过类似的方法获得了卡那霉素抗性的河套蜜瓜植株。

植物防御素PsD1可与细胞周期蛋白结合这一发现，开辟了一种人类肿瘤治疗的新思路[36,37,38]。事实上，植物防御素对特定种类人肿瘤细胞的抑制活性已有报道，如Vulgarinin能够抑制白血病的L1210和M1细胞系，抑制率分别为35%和80%，而其对乳腺癌MCF-7细胞系的抑制率为80%左右。人宫颈癌细胞系（Hela）能够被一种来自芙蓉菊的植物防御素所抑制，抑制率大约为80%，而limyin对人肝癌Bel-7402细胞系和神经母细胞SHSY5Y的IC50分别为43和28μM［39］。不过，植物防御素对癌细胞抑制活性的作用机理仍然没有得到解释。

总之，植物防御素以其广泛的抗菌谱和高效性的特点，有望发展成为一种新型抗菌药和抗肿瘤药物，对农业生产和人类健康带来深远影响。并且随着人们对植物防御素作用机制的不断了解，阐明其结构与功能的关系后，我们能够将其作为蛋白质工程的骨架，通过基因水平的改造，获得人们所期望的生物学活性。

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