微生物发酵法替代肉制品中亚硝酸盐呈色作用的研究进展

李沛军，孔保华*，郑冬梅

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

微生物发酵法替代肉制品中亚硝酸盐呈色作用的研究进展

李沛军，孔保华*，郑冬梅

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

亚硝酸盐在食品中的重要作用之一是促进肉制品产生粉红色泽，但由于其潜在的致癌性，使其应用受到限制。本文对目前研究的各种微生物在替代亚硝酸盐发色中的作用进行综述，对其发色机理进行讨论，并对微生物发酵法替代亚硝酸盐的未来发展趋势作出预测。

乳酸菌；亚硝酸盐替代；亚硝基肌红蛋白；肉制品

Abstract：One of the most important roles of nitrite in food industry is to improve the pink color of cured meat products.However, the use of nitrite is limited due to its potential carcinogenicity. In this paper, the alternation of microbial fermentation to nitrite addition for colorizing cured meat products has been reviewed and related mechanisms have been discussed. Moreover,the development trend of this alternation has been predicted.

Key words：lactic acid bacteria (LAB)；alternatives to nitrite addition；nitrosomyoglobin；cured meat products

肉的颜色是衡量肉和肉制品质量的最主要指标[1]，腌肉的粉红色泽更是消费者选择产品的重要标准。亚硝酸钠是目前肉品腌制的关键组分，其在肉制品中的作用主要有：抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长和毒素的形成，延缓食品腐败，阻止微生物的生长[2]，抗氧化[3]，产生腌肉的特征风味，以及与肌红蛋白作用，产生稳定的红色泽[4]。其中，亚硝酸盐的发色作用是其在肉制品中使用的主要原因之一。

然而，在肉中亚硝酸盐可以与仲胺类物质反应，生成N-亚硝基化合物[5]，这种物质具有致癌性、致畸性，特别与脑瘤和胃肠道癌变密切相关[6-7]。因此，引发了大量替代亚硝酸盐的研究。各种物质替代亚硝酸盐的研究报道已屡见不鲜，而微生物发酵法替代亚硝酸盐是一个较新的研究领域，我国在此方面研究较少。国外目前研究主要是在发色方面[8]，某些乳酸菌和其他微生物可在不添加亚硝酸盐的条件下，转化高铁肌红蛋白产生具有红色泽的肌红蛋白衍生物。

1 亚硝酸盐呈色作用及其替代物研究状况

肉的颜色取决于血红素蛋白的两种化合物，即血红蛋白和肌红蛋白及其存在形态。肌红蛋白为肉自身的色素蛋白，肉色的深浅与其含量多少有关。血红蛋白存在于血液中，对肉颜色的影响要视放血情况而定。放血良好的肉，肌肉中肌红蛋白色素占80%～90%，比血红蛋白丰富的多[9]。

亚硝酸盐作为一种很强的血红素氧化剂，首先和肌红蛋白反应，将肉由紫红色的肌红蛋白转化为棕色的高铁肌红蛋白。在还原条件下，随着时间推移，颜色会转化为亮红色的亚硝基肌红蛋白(NO-Mb)。而热变性会使其转化为亚硝基血色原(dinitrosyi ferrohemochrome，DNFH)，即NO-亚铁血色原，为稳定的粉红色[7]。

腌肉中使用硝酸盐或亚硝酸盐可能会引起一系列安全问题，归纳起来包括自身化学毒性，在食品中或食用后生成致癌物，以及危害动物生殖和发育等方面，在现行腌制肉中允许使用的硝酸盐或亚硝酸盐水平下，不会出现上述问题[10]。但由于亚硝酸盐作为潜在有毒物质，而且也发生过很多将其误作为其他成分用于食品或饮料中的事件，所以应控制好肉制品中亚硝酸盐的使用限量，避免中毒风险。

由于亚硝酸盐在食品中的重要作用和潜在危害，目前亚硝酸盐替代物研究较多，且部分成果已应用于实践或生产[11]。其中用于腌肉发色的亚硝酸盐替代物主要有：红曲色素[12]、番茄汁[13]、甜菜红[14]、山梨酸盐[15]、亚硝基血红蛋白[16]和胭脂树红[17]等。目前研究最多且已用于生产的是红曲色素，但自从法国学者在红曲霉的培养物中检测出一种对人体有害的真菌毒素(桔霉素)后[18]，引发了人们对红曲色素安全性的怀疑。因此，未来红曲色素的使用可能也将面临挑战。基于此，人们迫切需要一种新的方法来替代肉制品中的亚硝酸盐进行发色作用。

2 微生物发酵法替代亚硝酸盐发色研究进展

自从1993年日本人Arihara等[19]对1550株天然环境分离菌株和347株乳酸菌在培养基中转化高铁肌红蛋白(metmyoglobin，Met-Mb)的能力进行研究后，微生物发酵法替代亚硝酸盐发色的研究从未中断。目前已确定的菌株主要集中在以下几类。

2.1 乳酸菌发酵替代亚硝酸盐的研究

乳酸菌由于其在食品中的广泛应用而受到重点关注。研究表明，很多乳酸菌具有转化高铁肌红蛋白的能力。

2.1.1 发酵乳杆菌

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)属于肠道内的正常菌群，多用于非洲谷物类食品的发酵和豆豉的生产[20]，是食品工业应用较多的乳酸菌之一。发酵乳杆菌JCM1173可在deMann-Rogosa-Sharp(MRS)液体培养基中将棕色的高铁肌红蛋白转化为亮红色的肌红蛋白衍生物[19]，该衍生物光谱吸收带——α和β吸收带，分别位于577nm和544nm，且从中提取出的血红素部分的可见吸收光谱与NO-血红素相似，据此推断，得到的亮红色物质正是形成典型腌肉色泽的色素物质——亚硝基肌红蛋白(nitrosylmyoglobin，NO-Mb)。由于培养基中并未直接添加亚硝酸盐或硝酸盐，所以参与形成该色素物质的NO并非源于亚硝酸盐的降解，而是源于发酵乳杆菌自身的代谢作用。

此后，Morita等[21]将同位素标记的L-精氨酸作为MRS培养基氮源，发现在含有高铁肌红蛋白的培养基中，实验的10株发酵乳杆菌均可将高铁肌红蛋白转化为亚硝基肌红蛋白，且菌株发酵乳杆菌IFO 3956活性最强。同位素标记结果表明，发酵乳杆菌IFO 3956正是利用了L-精氨酸合成了亚硝基肌红蛋白生成所需的关键物质——NO。Morita等由此得出结论，该菌体内可能含有NO合成酶(NOS)，但并未对此进行系统的研究。

此后，Zhang等[23]再次将发酵乳杆菌AS1.1880(JCM 1173)应用于哈尔滨红肠的生产中，以部分替代腌制中使用的亚硝酸盐。当发酵乳杆菌制成的发酵剂接种量为108CFU/g时，香肠即可产生与亚硝酸盐腌制肉相当的色泽，光谱扫描分析表明这种红色素正是亚硝基肌红蛋白。并指出，尽管发酵乳杆菌AS1.1880可能成为香肠生产中亚硝酸盐的替代品，但是发酵乳杆菌和少量亚硝酸盐的搭配使用可能更具有效力。这样可以有效预防发酵乳杆菌的变异，从而保证产品的成功。

2.1.2 植物乳杆菌

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸杆菌的一种，多数从植物中分离得到，故得名，是食品发酵工业常用的菌种之一。土耳其人等[24]对从植物青贮饲料，混合青贮饲料和腌制黄瓜中分离出的细菌产NO的能力进行了研究。结果表明，5株植物乳杆菌具有产NO的能力，可将含有高铁肌红蛋白的MRS琼脂培养基变为红色，将高铁肌红蛋白转化为亚硝基肌红蛋白，但是他并没有在450～650nm扫描波长范围内观察到它的特征吸收峰。而此前对于植物乳杆菌的研究，植物乳杆菌JCM 1149[19]、LP1和DSM9843(LP2)[25]，均未测定出其具有转化高铁肌红蛋白的能力。这也说明了不同菌种，甚或是同一菌种的不同菌株，其产NO的能力均存在差异。

2.1.3 明串珠菌和片球菌

2.2 葡萄球菌发酵替代亚硝酸盐的研究

葡萄球菌广泛存在于传统肉制品中，它们在发酵肉制品中的主要作用是其硝酸盐还原酶活性，产生蛋白酶和脂酶，分解蛋白质和脂类，以及产生特殊的风味[26]。基于其在肉制品中的重要应用，很多研究者都把葡萄球菌列入了研究对象。

Morita等[27]对葡萄球菌替代亚硝酸盐发色进行了广泛而深入的研究。由肉块中分离的肉葡萄菌(Staphylcoccus carnosus)和溶酪葡萄球菌(Staphylococcus caseolyticus)，在培养基和肉基质中均可将高铁肌红蛋白转化为红色肌红蛋白衍生物；Mller等[22]在实验中将商用发酵剂——肉葡萄球菌XⅢ转化产生的这种红色衍生物进行了光谱扫描分析和电子自旋共振(electron spin-resonance，ESR)测定，结果证明这种肌红蛋白衍生物为氧合肌红蛋白；而从帕尔马(Parma)火腿中分离出的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)和缓慢葡萄球菌(Staphylococcus lentus)均可在Parma火腿中将高铁肌红蛋白转化为红色的肌红蛋白衍生物。ESR结果显示，这种红色衍生物不是已知的基态肌红蛋白、氧合肌红蛋白、高铁肌红蛋白和亚硝基肌红蛋白中的任何一种，而是一种新的肌红蛋白衍生物。

Morita等[28]将木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)FAX-1用于MRS培养基和意大利腊肠(Salami)中进行实验，结果表明，该菌株可在pH5.8的培养基中将高铁肌红蛋白转化为六配位NO的肌红蛋白配合物，而在较低pH值条件下则生成五配位的亚硝基肌红蛋白(NO-Mb)，且这种转化随pH值变化是可逆的；而在意大利腊肠中则只形成了五配位的亚硝基肌红蛋白，这种五配位的NO-Mb正是亚硝酸盐腌肉呈特征红色的物质。这与Mller等[22]研究的结果类似，发酵乳杆菌在MRS液体培养基中生成的和在发酵腊肠中生成的两种肌红蛋白衍生物，ESR光谱信号存在差异，这可能是由两种基质pH值的不同引起的，由于肌红蛋白残留相邻组氨酸的质子化作用，可能会导致NO-Mb的配位数由6个变为5个。

2.3 其他菌株

Faustman等[29]报道，在4℃牛肉糜中接种荧光标记假单胞菌(Pseudomonassp.)，高铁肌红蛋白水平下降，牛肉糜的颜色由棕转红。此外，细菌培养液在体外有效降低了高铁肌红蛋白浓度。根据这些推断源自细菌细胞的细菌代谢产物或胞内组分应是高铁肌红蛋白转化的原因，但对红色素提取物还没有进行最终确定。最新研究表明：莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)可将牛肉中高铁肌红蛋白转化成还原态的去氧肌红蛋白，从而使牛肉呈红色泽[30]。考虑到假单胞菌常常是导致肉品腐败的优势菌[31]，因此如何利用假单胞菌发酵替代亚硝酸盐发色尚需进一步的研究。尽管如此，对其的研究工作已经对阐明微生物发酵肉制品的发色机理做出了贡献[30]。

Arihara等[19]研究了从天然环境中分离出的菌株在Trypto-Soya培养基中转化高铁肌红蛋白的能力，结果表明，库特菌(Kurthiasp. K-22)、青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceumK-28)，可将高铁肌红蛋白转化为红色的肌红蛋白衍生物，光谱扫描分析表明，这种衍生物是氧合肌红蛋白。

3 微生物替代亚硝酸盐的呈色机理

微生物发酵法的呈色机理是将棕色的高铁肌红蛋白转化成了肌红蛋白的其他红色衍生物，包括氧合肌红蛋白、去氧肌红蛋白、亚硝基肌红蛋白和其他未知的肌红蛋白等。

3.1 氧合肌红蛋白和去氧肌红蛋白形成机理

商用发酵剂菌株戊糖片球菌PC-1和肉样葡萄球菌XⅢ，库特菌K-22和青紫色素杆菌K-28均将高铁肌红蛋白转化成了氧合肌红蛋白。究其原因，细菌对肉品颜色的作用一直归咎于细菌的氧化呼吸作用和肉表面的氧分压作用。理论上说，初期细菌消耗氧气，不同程度降低了氧分压，这就导致了高铁肌红蛋白的形成；而进一步的氧气消耗使得氧分压很低，促使高铁肌红蛋白降解[19]。这些细菌对肉表面和培养基中氧气的消耗很可能是氧合肌红蛋白生成的原因。而Motoyama等[30]的研究表明，莓实假单胞菌对肉的发色作用是由于其在牛肉表面形成了一层“生物被膜”，从而阻断了氧气进入肉中，加上细菌本身的消耗，极大降低了肉表面氧气的浓度，从而使得高铁肌红蛋白在极低的氧分压下转化生成红色的去氧肌红蛋白，使肉由棕色还原成红色。

3.2 亚硝基肌红蛋白形成机理

亚硝基肌红蛋白是由一氧化氮和肌红蛋白配位结合形成的，所以一氧化氮的来源问题便是亚硝基肌红蛋白形成的根本问题。对于一氧化氮的来源，研究者们也作了大量的研究工作，但至今未达成共识。

Morita等[21]利用同位素标记，发现发酵乳杆菌IFO 3956正是利用L-精氨酸合成了NO，说明该菌体内可能含有NO合成酶。而Xu等[25]对此进行了否定，他认为，Morita等[21]的实验并未直接对NO的生成进行测定，且没有进行NO合成酶抑制实验，而他忽视了细菌体内还存在一种L-精氨酸降解酶(ADI)，它可将L-精氨酸转化为NH4+，再通过细菌的硝化作用，进一步氧化为总氧化氮(TON)，因此该实验并不能得出发酵乳杆菌IFO3956体内含有NO合成酶的结论；他认为NO是源于MRS培养基中微量硝酸盐的降解。近来等[24]在10株可转化高铁肌红蛋白的菌株在MRS培养基发酵过程中，检测到了高达50μmol/L的NO浓度，从而也表明这些菌株都具有产NO能力，从而促使了亚硝基肌红蛋白的生成。目前大多数人支持Morita等[21]和等[24]的观点，认为培养基或肉基质中并不含有足量的亚硝酸盐，笔者也偏向于这种看法。

值得一提的是，以上涉及的可转化高铁肌红蛋白，产生腌肉色泽，从而可替代或部分替代亚硝酸盐的乳酸菌，包括植物乳杆菌、发酵乳杆菌和肠膜明串珠菌，它们对亚硝酸盐有很好的降解作用，降解率在98%以上[32]，这可能与NO的生成机制有关。

4 展 望

近些年随着人们对“绿色食品”和“有机食品”的日益重视[10]，亚硝酸盐替代物研究势在必行。微生物发酵法替代亚硝酸盐发色研究已具备一定的条件，且已应用于多种肉制品实验。由于其安全、绿色的优点，其替代前景广阔。目前，这些微生物转化高铁肌红蛋白的机制尚未清楚，未来的研究势必应集中到亚硝基肌红蛋白的生成机制上来，从代谢角度来阐明NO的生成途径。然而由于至今没有找到有效的肉毒梭菌抑制物质或方法来替代亚硝酸盐，因此目前替代亚硝酸盐的研究主要都是集中在发色、呈味等方面，不能达到完全替代的目的[33]。而对于微生物发酵法替代肉制品中的亚硝酸盐，目前研究仅仅集中在发色方面，未来研究中需要对微生物进行进一步深入研究，来替代亚硝酸盐的其他功能，诸如抑菌性、呈味和抗氧化性[34]，以期发酵法能完全替代亚硝酸盐。

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Microbial Fermentation as an Alternative to Nitrite Addition for Colorizing Cured Meat Products:a Review

LI Pei-jun，KONG Bao-hua*，ZHENG Dong-mei
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)17-0388-04

2009-12-30基金项目：国家公益性行业(农业)科研专项经费项目(200903012-02)；东北农业大学创新专项基金项目(CXZ011-2)作者简介：李沛军(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为畜产品加工与贮藏。E-mail：lipeijun1986@163.com*通信作者：孔保华(1963—)，女，教授，博士，研究方向为畜产品加工。E-mail：kongbh@163.com