5种野生浆果的抗氧化和抗细胞增殖活性

樊梓鸾，王振宇,2,*，程翠林，赵海田，张 华

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090； 2.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

5种野生浆果的抗氧化和抗细胞增殖活性

樊梓鸾1，王振宇1,2,*，程翠林1，赵海田1，张 华1

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090； 2.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

选取东北大兴安岭地区的特色浆果花楸(Sorbus pohuashanensisH.)、蓝莓(Vaccinium uliginosumL.)、蓝靛果(Lonicera caeruleaL.)、沙棘(Hippophae rhamnoidesL.)、草莓(Fragaria orientalisLos.)的成熟果实，采用80%丙酮提取，分别测定多酚、黄酮、花色苷含量，并研究其抗氧化活性和抗细胞增殖活性。结果表明：花楸的多酚和黄酮含量最高；蓝靛果的花色苷含量最高，为(367.5± 8.7)g/100g；5种浆果都具有较好的体外抗氧化活性，花楸显示了最高的抑制癌细胞增殖效应。

浆果；多酚；抗氧化；抗细胞增殖

Abstract：Some wild berries have been shown to have the functions of protecting against cardiovascular diseases, diabetes, and cancers due to the existence of phenolics. In the present study, the ripe fruits of five wild berries,Sorbus pohuashanensisH.(rowanberry),Vaccinium uliginosumL. (blue honeysuckle),Lonicera caeruleaL.,Hippophae rhamnoidesL., andFragaria orientalisLos., selected from the Greater Higgnan Mountains area of Northeast China were extracted with 80% acetone and the extracts were measured for their contents of total phenolics, total flavonoids and anthocyanins, ABTS+·, DPPH and total oxyradical scavenging capacities and anti-proliferative activities against HepG2 and HT29 cell (MTS assay). The results showed that rowanberry had the highest contents of total phenolics and total flavonoids among all the five berries, while blue honeysuckle had the highest anthocyanin content (367.5±8.7) g/100 g. All the five berry extracts could exert antioxidant activitiesin vitro, of which rowanberry showed the highest inhibition effects on the proliferation of HepG2 and HT29 cells. As a conclusion,rowanberry has a huge potential for being developed as effective cancer drugs.

Key words：berries；phenolics；antioxidant activity；antiproliferative activity

自由基是人体组织中许多生化反应的中间代谢产物。正常情况下，体内自由基的产生和消除处于动态平衡中，但若是体内自由基产生过多或消除过慢，自由基就会在分子水平、细胞水平以及器官水平产生毒害作用，损伤细胞成分、破坏细胞的结构和功能，给机体造成损伤，这个过程称之为氧化应激或氧胁迫(oxidative stress)[1]。饮食多酚类化合物可以作为抗氧化剂，启动细胞的天然防御机制，预防由自由基产生的损伤和阻断癌症的发生[2]。

野生浆果中富含植物化学物，其提取物具有很强的抗氧化活性，可以减少脂质过氧化，降低胆固醇[3]以及抑制结肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞的生长。浆果中天然存在的植物化合物的联合作用在抗氧化以及肿瘤预防方面至关重要[4]。通过浆果中多酚、类黄酮以及花色苷功能物质含量的检测以及探讨浆果提取物抗氧化和抗肿瘤细胞增殖，对于揭示浆果提取物预防肿瘤的作用机制以及开发研制新型抗癌药物具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花楸(Sorbus pohuashanensisH.)、蓝莓(Vaccinium uliginosumL.)、蓝靛果(Lonicera caeruleaL.)、沙棘(Hippophae rhamnoidesL.)、草莓(Fragaria orientalisLos.)，于成熟季节采摘于大兴安岭加格达奇，冷冻保存。

(+)-Catechin、Folin-Ciocalteu(FC) reagent、DPPH、ABTS、4-甲硫基-2-丁酮酸钠盐(KMBA)、Trolox Sigma公司；2,2’- 偶氮双(2-眯基丙烷)二盐酸盐(ABAP)日本Wako Chemical公司；硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、盐酸、胎牛血清、氯化铝、亚硝酸钠等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

气相色谱仪、10mL硬质顶空瓶 美国Agilent 公司；恒温振荡水浴箱 上海科器公司；JJ-2型组织粉碎机 常州国华公司；FA25型高速均质机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；550 iMark酶标仪 美国伯乐公司。

1.3 方法

1.3.1 活性成分的提取

用电子天平精确称取冻存浆果100g，加入200mL 冷冻的80%丙酮在组织捣碎机中匀浆5min，从捣碎机中取出匀浆，在高速均质机中均质3min，真空抽滤。收集滤液置于旋转蒸发仪中，在45℃旋转蒸发至约10%的提取液，将其转移至容量瓶，定容分装，于－80℃储存[5]，用于后续抗氧化和细胞实验。

1.3.2 抗氧化物质的测定

1.3.2.1 总酚的测定

采用菲林酚比色法检测多酚含量[6]。精密吸取125μL没食子酸标准溶液或浆果提取物，分别置于l0mL试管中，加入0.5mL的蒸馏水，再加入125μL的菲林酚试剂(FCR)，样品混合充分，静置6min，加入1.25mL 7g/100mL Na2CO3水溶液。用水补足终体积到3mL。90min后在760nm波长处测定蓝色溶液的吸光度。没食子酸作标品，结果以没食子酸等同量(mg)/l00g鲜质量表示。

1.3.2.2 黄酮的测定

采用AlCl3比色法检测总黄酮含量[7]。儿茶素为标准品进行测定，结果以mg/l00g鲜质量表示。精密吸取0.25mL儿茶素标准溶液或浆果提取物，分别置于l0mL试管中，加入0.5mL的蒸馏水，再加入75μL 5g/100mL NaNO3溶液，混合均匀，6min后加入150μL 10g/100mL AlCl3·6H2O，摇匀放置5min；然后加入0.5mL lmol/L的NaOH溶液，用水补足终体积到2.5mL，混匀，于波长510nm条件下，利用分光光度计比色，以试剂为空白参比，测定不同溶液的吸光度。

1.3.2.3 花色苷的测定

单节花青素含量用pH示差分光光度法[8]。提取物用0.025mol/L pH 1的氯化钾缓冲液及pH 4.5乙酸钠缓冲液按比例混合，分别在515nm和700nm波长处测定吸光度，以蒸馏水为空白比色。花青素的含量用式(1)计算。总单花青素/(mg/100g鲜果)＝A×MW×1000×E×c(1)

式中：A为吸光率(A515nm－A700nm)pH1.0－(A515nm－A700nm)pH4.5；MW为花色苷3-糖配基的相对分子质量449.2；E为花色苷3-糖配基的摩尔吸光率26900；c为缓冲溶液的质量浓度/(mg/mL)；每100g鲜果皮中花色苷的含量用花色苷3-糖配基的毫克数表示。

1.3.3 抗氧化能力的测定

1.3.3.1 DPPH法测定抗氧化能力

参照文献[9]，将样品稀释配制成一系列浓度，取0.1mL样品加入1.5mL DPPH甲醇溶液，混合30min后测定515nm波长处吸光度。每份样品平行操作3次，按照公式(2)计算清除率。

式中：AContral为1.5mL DPPH溶液与0.1mL甲醇混合后的吸光度；ASample为1.5mL DPPH溶液与0.1mL样品混合后的吸光度。

1.3.3.2 ABTS法测定抗氧化能力

按照文献[8]。配制ABTS自由基工作液。将样品用甲醇配制成一系列浓度，取0.1mL样品加入1.5mL ABTS自由基工作液，混合，放置6min后，在734nm波长处测定吸光度。每份样品平行操作3次，按照公式(3)计算清除率。

式中：AContral为1.5mL ABTS溶液与0.1mL甲醇混合后的吸光度；ASample为1.5mL ABTS溶液与0.1mL样品混合后的吸光度。

1.3.3.3 TOSC法测定总氧自由基清除能力

以0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配制0.2mol/L ABAP、0.25mmol/L KMBA(均为临用时现配，4℃避光贮存)，在顶空瓶中加入KMBA 0.8mL和PBS 0.1mL作为控制管，加人KMBA 0.8mL和样液0.1mL (0.4～40 mg/mL)作为样品管，分别加盖密封后用注射器注入0.1mL ABAP，使溶液终体积为1mL。将顶空瓶放入35℃水浴振荡反应60min，立即抽取顶空气体0.6mL按1.3.4节条件进样[10]。按照公式(4)计算总氧自由基清除能力。

式中：AS和AC分别为样品管和控制管的乙烯峰面积。

1.3.4 气相色谱测试条件

测试条件：安捷伦HP-PLOT Q毛细管柱 (15m×0.530mm，40μm)；进样器、色谱柱、检测器温度分别为100、40、300℃；载气(N2)：氢气、空气流速分别为40、50、500mL/min；检测器为火焰离子化检测器(FID)。

1.3.5 统计分析

用Sigmaplot 10.0分析软件进行统计分析，数值计算采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 抗氧化物质含量的比较

5种浆果提取物的多酚、黄酮、花色苷含量如图1所示。经统计分析可知，不同浆果中多酚、黄酮、花色苷含量差异性显著(P＜0.001)。多酚和黄酮在花楸浆果中含量最高，分别达到(625.3±6.9)mg/100g和(556.4±15.7)mg/100g；在草莓浆果中含量只有(127±31.6)mg/100g和(94.2±11.7)mg/100g；而花色苷在蓝靛果中含量最高，为(358.8±16.4)mg/100g 鲜果，其次为蓝莓、草莓、花楸和沙棘。此结果与文献[11]报道的浆果提取物相比，花楸的多酚和黄酮含量显著高于其他浆果，草莓含量相比低于文献报道，可能由于植物生长环境和种属基因型对酚类化合物的积累起主要因素。

图1 5种浆果样品总酚含量Fig.1 Contents of total phenolics of five wild berries (mg/100 g)

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 ABTS+·和 DPPH自由基法测定提取物的抗氧化活性

一般来讲，自由基化学性质活泼，寿命极短，但也有例外，ABTS+·和 DPPH自由基是国内外公认的性质稳定的自由基，常用于抗氧化活性的筛选[12-13]。5种浆果对ABTS+·和 DPPH自由基的清除能力见图2。由图2可知，随着加入质量浓度的增大，各种浆果清除ABTS+·和 DPPH自由基的能力也依次增强，呈良好的剂量效应关系。但5种浆果的清除活性存在一定差异。多酚含量高的花楸和蓝靛果对ABTS+·和 DPPH自由基的清除活性也相对较强。当加入质量浓度为40mg/mL时，花楸和蓝靛果提取物对ABTS+·的清除率分别达到96.12%和95.03%；当加入质量浓度为150mg/mL时，对DPPH自由基的清除率分别达到80.05%和80.23%，而多酚含量最低的草莓在以上两种质量浓度下，对A B T S+·和DPPH自由基的清除率仅为46.66%和25.82%。5种浆果自由基清除活性的EC50值显示其清除活性的大小顺序依次为花楸＞蓝靛果＞蓝莓＞沙棘＞草莓。明显可以看出，DPPH法评价出的抗氧化能力比ABTS法要低。可能是由于DPPH对亲水性的抗氧化物质不太敏感[14]。所以在评价抗氧化能力时，应采用多种方法来综合评价。

图2 5种浆果提取物清除ABTS+·和DPPH自由基的剂量效应关系Fig.2 Dose-response curves of ABTS+· and DPPH radical scavenging activity of five berry extracts

2.2.2 TOSC法测定总氧自由基清除能力

Winston等[10]建立了一种以气相色谱为检测手段测定机体的总氧自由基清除能力(total oxyradical scavenging capacity，TOSC)的方法，该方法和其他同类测定抗氧化能力的方法相比，除了具有简便、灵敏、快速、对仪器设备无特殊要求等优点外，它最大的优越性是任何可与氧自由基结合的物质所发挥的作用都被考虑，因而反映的是机体所具有的总抗氧化能力，这在评价化学物对生物是否造成氧化损伤时有特别重要的意义，这是单项抗氧化剂指标所无法比拟的。此外，由于TOSC的计算是将加入样品所得乙烯的峰面积与对照相比，因而所得的TOSC受仪器灵敏度的变化及其他分析状态的影响较小，因此，其可行性和重现性也较好。

5种浆果均有较强的总氧自由基清除能力，随着浆果提取液加入浓度的增大，乙烯峰面积也随之减小，并呈现较好的量效关系。根据样品不同浓度的TOSC值拟合方程可求出抑制乙烯生成50%时各种样品的浓度(EC50)。以VC为对照，结果表示为每g样品相当于多少 VC的量(μmol)。其值越高说明抗氧化能力越强。由图3可知，5种浆果总抗氧化活性有所不同，其总抗氧化活性由强到弱的顺序为：花楸＞蓝靛果＞蓝莓＞沙棘＞草莓。此结果与多酚含量及对ABTS+·和DPPH自由基的清除活性显著相关。结果指出，样品的植物化学提取物发挥了潜在的抗氧化活性。不同的浆果，处理方法不同，栽培条件或是储存条件都会显著影响总抗氧化物含量[15]。

图3 5种浆果提取物的总抗氧化活性Fig.3 Total oxyradical scavenging capacities of 5 berry extracts

2.3 抗细胞增殖活性分析

图4 5种浆果提取物抗细胞增殖活性的剂量效应关系Fig.4 Dose-response curves of antiproliferative activity of 5 berry extracts

癌症是人体细胞失去正常调控机制而失控性生长的一种疾病。癌症可发生于任何器官中的任何组织。从基因的角度来讲，就是各种原因导致癌基因的激活和/或抑癌基因的失活，使基因突变的细胞失去调控而不断复制，由此对人体组织器官产生损害。

当前，抗癌主要研究方向是抑制肿瘤发生、诱导肿瘤细胞的分化或凋亡。凋亡是细胞死亡的一种方式，以保证机体的正常功能。氧化应激(oxidative stress)是导致化学的或代谢来源的ROS产生的一种细胞内或外的状态。现已探明肿瘤细胞中氧自由基及其代谢产物明显高于正常组织，这些自由基是癌细胞内某些基因(如Ras等)生长信号传导途径的重要环节，可刺激肿瘤细胞分裂、增殖，进而影响细胞凋亡等代谢活动[16]。因此，开发天然来源的新抗肿瘤药物，可有效的清除肿瘤细胞中氧自由基，抑制癌细胞的增殖，诱导凋亡，对癌症的预防和控制起到了举足轻重的作用。

从图4可以看出，5种浆果提取物对结肠癌HT29和肝癌HepG2细胞均有生长抑制效应，其抑制作用成质量浓度依赖性，抑制率随提取物质量浓度的升高而增加。花楸提取物对两种细胞的抑制作用随质量浓度的变化较其他4种显著。经计算得出，花楸提取物与HT29和HepG2细胞共同培养48h后测得EC50分别为38.01mg/mL和25.65mg/mL。

由图5可知，对于结肠癌HT29细胞，抑制细胞增殖活性依次为花楸＞蓝莓＞沙棘＞草莓＞蓝靛果；而对于人肝癌HepG2细胞，抑制细胞增殖活性依次为花楸＞沙棘＞蓝莓＞草莓＞蓝靛果。

3 讨 论

随着现代生命科学的逐步发展，活性氧和自由基研究已成为近20年来该领域的前沿和热点。1956年，英国科学家首先提出了自由基学说，认为自由基攻击生命大分子造成组织细胞损坏，是引起机体病变的重要原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。

近年来，关于天然产物抗氧化活性的研究十分引人注目，从天然材料提取、精制而得到的产品——天然产物对人体的多种疾病往往具有很好的治疗、预防等药理作用和保健功能[17]。据报道，自然界中的蔬菜、水果、花和谷物中存在具有多种生物活性的天然产物，其中一些天然产物在抗氧化性、清除自由基作用方面有突出的表现，这对于抗癌、防癌、抗衰老、预防心血管疾病，提高人民身体健康会产生积极的作用。

本实验较为系统地研究了我国北方特产的5种野生浆果的酚类化合物组成、抗氧化活性和抗细胞增殖活性。在3种抗氧化体系中，花楸、蓝靛果和蓝莓表现出较高的抗氧化活性，沙棘和草莓次之，其抗氧化活性与提取物的质量浓度呈正相关。花楸对两种癌细胞的抑制活性最强，蓝靛果对癌细胞的抑制活性较弱，与其多酚含量没有显著的相关性。

[1] KOUAKOU-SIRANSY G, SAHPAZ S, IRIE-NGUESSAN G, et al.Oxygen species scavenger activities and phenolic contents of four West African plants[J]. Food Chemistry, 2010, 118(2):430-435.

[2] HOGAN S, CHUNG H, ZHANG L, et al. Antiproliferative and antioxidant properties of anthocyanin-rich extract from acai[J]. Food Chemistry,2010, 118(2):208-214.

[3] ROUANET J, DECORDE K, DEL-RIO D, et al. Berry juices, teas,antioxidants and the prevention of atherosclerosis in hamsters[J]. Food Chemistry, 2010, 118(2):266-271.

[4] LIU Ruihai. Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic combinations of phytochemicals[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2003, 78(3):517S-520S.

[5] LIU Ming, LIN Luoqiang, SONG Bingbing, et al. Cranberry phytochemical extract inhibits sgc-7901 cell growth and human tumor xenografts in balb/c nu/nu mice[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(2):762-768.

[6] WANG Min, LIU Jiaren, GAO Jinming, et al. Antioxidant activity of tartary buckwheat bran extract and its effect on the lipid profile of hyperlipidemic rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009, 57(11):5106-5112.

[7] YANG Jun, LIU Ruihai, HALIM Linna. Antioxidant and antiproliferative activities of common edible nut seeds[J]. Lwt-Food Science and Technology, 2009, 42(1):1-8.

[8] BAO Jinsong, CAI Yizhong, SUN Mei, et al. Anthocyanins, flavonols,and free radical scavenging activity of Chinese bayberry (Myrica rubra)extracts and their color properties and stability[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(6):2327-2332.

[9] LOIZZO M R, SAID A, TUNDIS R, et al. Antioxidant and antiproliferative activity ofDiospyros lotusL. extract and isolated compounds[J]. Plant Foods for Human Nutrition, 2009, 64(4):264-270.

[10] WINSTON G W, REGOLI F, DUGAS A J, et al. A rapid gas chromatographic assay for determining oxyradical scavenging capacity of antioxidants and biological fluids[J]. Free Radical Biology and Medicine,1998, 24(3):480-493.

[11] SUN Jie, CHU Yifang, WU Xianzhong, et al. Antioxidant and anti proliferative activities of common fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(25):7449-7454.

[12] TERPINC P, BEZJAK M, ABRAMOVIC H. A kinetic model for evaluation of the antioxidant activity of several rosemary extracts[J]. Food Chemistry, 2009, 115(2):740-744.

[13] 付陈梅, 焦必宁, 阚建全. 果蔬总抗氧化能力间接测定法及其影响因素[J]. 食品科学, 2008, 29(4):457-460.

[14] 但俊峰, 盛雪飞, 陈健初. 5种柚汁中主要抗氧化成分含量及其抗氧化能力的比较[J]. 食品科学, 2008, 29(7):90-93.

[15] XU Changmou, ZHANG Yali, CAO Lei, et al. Phenolic compounds and antioxidant properties of different grape cultivars grown in China[J].Food Chemistry, 2010, 119(4):1557-1565.

[16] MUSCHEL R J, BERNHARD E J, GARZA L, et al. Induction of apoptosis at different oxygen tensions:evidence that oxygen radicals do not mediate apoptosisi signaling[J]. Cancer Research, 1995, 55(5):995-998.

[17] VISAVADIYA N P, SONI B, DALWADI N. Free radical scavenging and antiatherogenic activities ofSesamum indicumseed extracts in chemical and biological model systems[J]. Food and Chemical Toxicology, 2009,47(10):2507-2515.

Antioxidant and Antiproliferative Activities of Five Wild Berries

FAN Zi-luan1，WANG Zhen-yu1,2,*，CHENG Cui-lin1，ZHAO Hai-tian1，ZHANG Hua1
(1. College of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China；2. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

TS201.4；R151.3

A

1002-6630(2010)17-0148-05

2010-06-29

樊梓鸾(1981—)，女，博士研究生，研究方向为天然产物分离纯化及功能性。E-mail：fzl_1122@163.com

*通信作者：王振宇(1957—)，男，教授，博士，研究方向为活性成分分离合成与调控、新资源开发与利用。E-mail：wzy219001@yahoo.com.cn