高含量芽孢杆菌益生菌的制造技术

刘华梅 陈振民 李青 谢翔

20世纪50年代以来，抗生素作为疾病治疗剂和动物生长促进剂对畜禽、水产养殖业的发展发挥了重大作用。然而，大规模集约化养殖业的快速发展导致抗生素的过度滥用，使食品安全受到日益严峻的挑战，近年来，欧洲、美国、日本等发达国家已明令禁用抗生素作为饲料添加剂，并在积极地寻找抗生素的替代品。人们研究发现，益生菌用于饲料添加剂饲喂动物，能很好地控制动物病原菌的增殖、促进动物生长作用，同时不会出现耐药性，也不存在有害残留或污染等副作用，因此，目前益生菌已经发展成为替代抗生素、控制动物疾病的最有效的工具之一。其中芽孢杆菌益生菌，如凝结芽孢杆菌(Bacillu coagulans)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)、地衣芽孢杆菌 (B.licheniforms)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)等，由于其具有抗逆性强、耐储藏、应用条件不苛求等优良性状，全部或部分被美国FDA、中国农业部列入可直接用于饲料添加剂的菌种目录，成为目前应用最为广泛的一种益生菌，对畜禽、水产业都显示良好的应用效果。

但是，当前我国益生菌产业还处在起步阶段，产品纯度和含量低，产品稳定性差，使用效果也不很理想。但随着科技的发展，研究的不断深入，益生菌产业必将朝着健康、规范、高水平方向发展。目前，武汉科诺公司采用先进的制造技术，已分别开发出活芽孢高含量的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产品，活芽孢数分别达到10000亿个活芽孢/g，并申请了国家专利。

1 多种生物学技术保障了高效安全的菌种筛选与鉴定

作为活菌制剂，在菌种的筛选时，一定要进行系统的安全性毒理学试验，确定无毒副作用，并经权威机构鉴定后，方可用于生产，这是保证产品安全的前提条件，避免可能存在的安全隐患。其次，菌种应具有优良的特性，能耐受动物肠道内的极端条件，包括胃中的酸性环境和十二指肠中的胆汁，同时产品还应能耐受饲料制粒过程中的热处理。分离在不同条件下收集的芽孢杆菌样品，通常采用显微观察、生理生化试验、现代微生物鉴定系统-API系统（API50试剂盒）及16S rRNA基因的PCR扩增等生物学技术对菌株进行鉴定与选育。经过优选的芽孢杆菌同时应具有以下特性：生长迅速、生物量高、良好的产芽孢能力，有耐酸、耐碱、耐高温的良好稳定性及优良的产酸、产酶、产维生素等性能。同时对目标菌种进行安全性鉴定，评价其对动物和环境的影响，如急性毒性试验和毒理学试验等。最后选择高效、安全的芽孢杆菌作为生产菌种，进行保藏，并定期对生产菌种进行安全性检测。

2 响应面方法优化培养基显著提高了芽孢杆菌的发酵水平

培养基的营养成分（如碳源、氮源、微量元素和生长因子）是影响微生物生长、繁殖和代谢的重要因素。针对原料不同的来源、价格、产地及运输情况，综合考虑其投入产出比，优选来源容易、价格低廉、芽孢产率高的培养基成分用于工业生产，如葡萄糖、淀粉、大米粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白粉，玉米蛋白粉、大米蛋白粉、鱼粉、硫酸铵、硝酸铵等碳氮源及对生长和芽孢形成有促进作用的Co2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、P2+、Na+、K+等微量元素。

采用单因素实验，考察以上不同的培养基成分对芽孢产量的影响，优选8～20种培养基成分用于响应面优化。主要包括部分因子筛选实验，最陡坡试验和中心组合设计，主要考察各种营养成分对发酵生物量、芽孢数和发酵周期的影响，并采用多元一次和二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，优化得到1～2个成本低廉、芽孢产率高、易于操作的工业化生产的培养基组成，使芽孢杆菌发酵水平达到活芽孢数150亿个活芽孢/ml以上。

3 高密度补料发酵技术提高芽孢杆菌的发酵水平

除了营养成分和培养条件对发酵水平有重要影响外，发酵工艺和方式也对发酵水平和产率有重要影响。

芽孢杆菌益生菌可采用固体发酵和液体发酵两种方式。固体发酵是把益生菌接种到固体培养基上进行发酵培养，优点是管理粗放，工艺简单，投资较少，但有易受杂菌污染、菌体含量不易控制、产品质量和应用效果不稳定、安全性不能保证等缺点。液体深层发酵采用现代发酵技术，将益生菌菌种接种到反应器中进行通风培养，对整个发酵过程进行精细的过程控制，无菌培养，产品质量稳定，适合工业化生产，但技术水平要求较高，随着各国政府对食品安全的高度关注，液体深层发酵必将是未来益生菌产业化发展的方向。

采用有效提高发酵生物量和产率的高密度液体补料发酵技术，制造出高含量芽孢杆菌益生菌。首先利用响应面优化培养基，进行分批发酵动力学研究，包括研究不同培养温度、pH值、通气比、转速、溶氧和消泡剂对芽孢形成和泡沫的控制的影响，得到一个最佳的分批发酵工艺条件，然后进行补料分批发酵工艺优化，着重研究不同基质、不同补料方式（恒速补料和变速补料）和不同补料时机对高密度培养的影响，确定高密度发酵条件及工艺，使芽孢形成率达95%以上，活芽孢数200亿个/ml以上。

4 高效清洁的芽孢回收技术保证了较高的活芽孢回收率和高含量产品

提取与回收工艺是影响产品的品质、收率和稳定性的重要环节，如何有效的回收稳定性的芽孢和制备高含量的枯草芽孢原粉一直是本行业的难点。

通过比较和优化多种提取和回收方式对芽孢收率、质量和稳定性的影响，包括不同的回收方式（如工业离心、板框过滤、膜过滤技术、真空浓缩、生物絮凝剂）、干燥方式（冷冻干燥、真空烘干和喷雾干燥等方式）以及不同消毒剂和消毒方式对环境中噬菌体和杂菌的杀灭效果，综合考虑效率、收率、成本及环境影响等因素，最终选择终产品的品质高、稳定性好、操作简单、环境洁净及生产兼容性好的优化工艺组合，使芽孢回收率达90%以上，制备出活芽孢10000亿个活芽孢/g的芽孢杆菌产品。

5 独创的高含量活芽孢数的检测技术有力保障了检测结果的准确性

活菌计数技术作为常规的微生物学技术，是衡量细胞生物量和产率的重要手段。高含量芽孢杆菌原药（10000亿个活芽孢/g）中，芽孢成分占到90%以上，由于芽孢高度集聚，芽孢所携带的静电等因素使芽孢很难分散，使用常规的平板计数技术，检测结果的变异系数往往非常大，难以准确判断其真实值，一直是本行业的难点之一。

通过研究不同的表面活性剂、不同的振荡打散方式及不同的操作流程对芽孢准确性和重复性的影响，建立一套精确度高、重复性好，易操作的检测流程，包括稀释液添加表面活性剂吐温-80，对样品进行磁力搅拌和超声波预处理，80℃水浴处理杀灭营养体和不完整芽孢，保证产品活芽孢数检测的准确与有效，使检测变异系数可以控制在3.5%以内。

6 综合采用多种先进生物学技术保障了产品的纯度

产品的纯度保证产品的高品质、良好的应用效果及安全性的重要指标之一，越来越受到行业，特别是发达国家的重视。科诺公司采用显微观察、平板划线、菌种特性鉴定、API50-CHB及16SrRNA的PCR鉴定等技术，并通过对菌种特有功效特性的鉴定。分别对菌种、中间品和产品进行纯度鉴定，保证了生产过程无污染和产品的同源性。

7 结语

高品质芽孢杆菌等饲用益生菌推广使用，不仅直接为取代抗生素提供有效解决途径，同时也对我国无抗生素残留的动物产品出口带来积极效果，并在垃圾除臭、染污水体修复领域取得初步成效，进一步显示良好的社会和生态效益。